發(fā)布時間：2016-11-15 16:26

  本文關鍵詞：河北省腎綜合征出血熱主要流行區(qū)漢坦病毒的基因變異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《河北醫(yī)科大學》 2014年

河北省腎綜合征出血熱主要流行區(qū)漢坦病毒的基因變異研究

蔡亞男  

【摘要】：目的：了解河北省腎綜合征出血熱（HFRS）主要流行區(qū)疫情變化特征，研究該地區(qū)宿主動物所攜帶漢坦病毒（HV）基因型別和隨時間基因變異情況，指導對本病的預防和控制。 方法： 1收集1996-2013年河北省HFRS主要流行區(qū)疫情資料，總結(jié)HFRS主要流行區(qū)宿主動物的密度、帶毒率和鼠種構(gòu)成等流行病學資料變化特征。 2夾夜法捕鼠，無菌取鼠肺，用冷凍切片機切鼠肺，冷丙酮固定，間接免疫熒光法（IFA）篩選HV陽性鼠肺。 3從陽性鼠肺和保存毒株中提取總RNA，應用熒光定量PCR進行基因分型。 4RT-PCR法擴增G1、G2部分片段及全M基因片段，全M基因片段的產(chǎn)物純化后經(jīng)TA克隆連接入pMD19-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化入DH5α菌。 5篩選陽性重組質(zhì)粒，提取后測序，用DNAStar軟件進行序列拼接后，用分子進化方法和軟件分析病毒核苷酸和氨基酸的同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對河北省主要流行區(qū)鼠攜帶HV的核苷酸變異及特征進行分析。 6應用軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 1河北省東北部唐山和秦皇島市自2001年以來，HFRS發(fā)病率明顯高于河北省其他地市，2008年兩地市HFRS病例大幅攀升，于2013年達河北省HFRS病例總數(shù)的90%，目前是我省HFRS的主要流行區(qū)。 2唐山市和秦皇島市2004-2013年平均鼠密度為2.26%，其中居民區(qū)為2.75%，野外為1.16%，二者有逐年上升的趨勢。兩地市平均鼠帶毒率為10.29%，其中居民區(qū)為11.23%，野外為2.96%。居民區(qū)與野外鼠密度、帶毒率總體均有顯著性差異。 唐山和秦皇島市2009-2013年鼠類種群構(gòu)成經(jīng)分類鑒定，居民區(qū)和野外的主要優(yōu)勢鼠種都是褐家鼠，但居民區(qū)與野外的鼠種構(gòu)成具有顯著性差異。 3對河北省HFRS主要流行區(qū)IFA陽性鼠肺及毒株采用實時熒光定量PCR進行分型擴增，結(jié)果顯示21份陽性標本所攜帶HV均為SEO型，未發(fā)現(xiàn)HTN型。 4選擇研究需要有代表性標本擴增G1、G2基因片段并測序，共獲得13個G1片段和14個G2片段序列。HV G1（217-573nt）基因核苷酸同源性為95.5%-100%，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ17/2012比較分別為95.5%、95.8%，TS-2/2004和HBQ20/2007比較為100%，HBT49/2013和HBT50/2013比較也為100%。與R22株進行比較，同源性較高，為94.5%-96.3%，與76-118株的同源性較低，僅為69.9%-71.8%。HV G2（2002-2301nt）基因核苷酸序列同源性比較結(jié)果表明，同源性高達97.4%-100%，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ5/2012的同源性均為97.4%，HBQ7/2013和HBQ17/2012的同源性為100%，以及TS-2/2004、HBQ20/2007和HBQ43/2009比較同源性均為100%。與R22株和76-118株的同源性比較分別為90.8%-92.7%和71.3%-72.6%�？梢娡椭gM片段的基因序列相對比較保守，提示HV沒有發(fā)生較大的基因變異。 5根據(jù)G1(217-573nt)和G2(2002-2301nt)片段用DNAStar軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。G1片段進化樹顯示QHD-1/2004、TS-2/2004、HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株與BjHD01株在同一支，親緣關系較近，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、changchun株在同一分支，親緣關系較近，均屬于SEO型病毒的S3亞型。G2片段系統(tǒng)進化樹顯示，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、ZT10株在同一分支，親緣關系較近，TS-2/2004、 HBT67/2011、 HBT69/2011、 HBT-3/2012、 HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株與cp27c株在同一支，親緣關系較近。14份標本均在同一大的分支，即SEO型病毒的S3亞型。結(jié)果顯示雖同在S3亞型，但93HBQ3、93HBQ4與其它株系統(tǒng)提示已發(fā)生明顯變化。 6建立了從鼠肺直接擴增全M基因片段的方法，成功構(gòu)建了M基因片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)測序共獲得11個M片段全序列，結(jié)果顯示M基因片段全長3651nt，由5’非編碼區(qū)、開放閱讀框以及3’非編碼區(qū)三部分組成。5’和3’非編碼區(qū)的長度分別為47nt、203nt。只存在一個全長為3402nt的完整開放閱讀框，編碼1133個氨基酸的病毒蛋白前體。與其他HV一樣，M基因片段的RNA其3’和5’末端反向互補，形成鍋柄狀二級結(jié)構(gòu)。 711株病毒標本之間核苷酸同源性為95.8%-99.8%，其中93HBQ3和93HBQ4與其他9株病毒核苷酸同源性為95.8%-97.0%。而93HBQ3和93HBQ4兩株病毒之間的同源性為98.7%，其他9株病毒之間核苷酸同源性高達98.6%-99.8%。且11份標本均與SEO型HV的毒株（R22、L99、BjHD01、Z37）核苷酸的同源性較高，在83.6%-99.2%之間，與HTN型（Q32、Lee、76-118）核苷酸同源性較低，僅為70.0%-71.7%。進一步提示HV沒有發(fā)生較大的基因變異。 8M片段構(gòu)建的進化樹顯示HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株與BjHD01在同一小支，親緣關系較近，93HBQ3、93HBQ4和Z37、ZT10在同一小支，親緣關系較近，但11份標本與上述參考毒株均在同一分支，均屬于S3亞型，而與76-118、Lee、Q32親緣關系較遠。G1、G2基因部分片段系統(tǒng)進化樹分型結(jié)果與M基因全序列分型結(jié)果一致。 結(jié)論： 1唐山和秦皇島市是河北省HFRS的主要流行區(qū)，近幾年疫情呈上升趨勢。褐家鼠是該地區(qū)的優(yōu)勢鼠種，并且是HFRS的主要傳染源。 2河北省HFRS主要流行區(qū)宿主動物所攜帶的HV基因型為SEO型，基因亞型為S3亞型。 3河北省HFRS主要流行區(qū)鼠攜帶HV基因未發(fā)生較大變異，同型之間M片段序列相對較保守，，但同一亞型內(nèi)不同病毒株存在明顯變異。 4短期時間內(nèi)HV的基因變異不大，但長期時間HV基因變異會有顯著變化。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R512.8;R181.3
【目錄】：

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本文編號：175900