本文選題：蝙蝠　切入點：登革病毒　出處：《南方醫(yī)科大學》2008年碩士論文

【摘要】：研究背景 蝙蝠屬于哺乳動物中的翼手目(Chiroptera),其數(shù)量在哺乳乳類中僅次于嚙齒目,全世界蝙蝠大約有17科180屬,約960種,其中我中有7科29屬107種。翼手目分兩個亞目:大蝙蝠亞目(Megachiroptera),又稱狐蝠,我國有1科5屬7種;小蝙蝠亞目(Microchiroptera),即通常所說的蝙蝠,我國有6科24屬100種。大蝙蝠類分布于東半球熱帶和亞熱帶地區(qū),體形較大,身體結構也較原始,只有狐蝠科1個科。小蝙蝠類分布于東、西半球的熱帶、溫帶地區(qū),體型較小,包括菊頭蝠科、蹄蝠科、葉口蝠科、吸血蝠科、蝙蝠科等十余科。 蝙蝠對人類而言是有益的動物,部分種類與人類接觸密切,是一個可以與人類和諧共處的重要物種。然而,研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠是多種人類病毒性疾病病原體的儲存宿主。已知有25個病毒科能夠感染脊椎動物,其中有10個科和蝙蝠有關,且主要是RNA病毒。在感染脊椎動物的16個RNA病毒科中,至少有9個科可感染蝙蝠。迄今為止,已在蝙蝠體內(nèi)分離到80多種病毒,其中一些是多種重大人獸其患疾病的傳染源,對人類健康構成了巨大威脅。近年來,一些新病毒病的暴發(fā)、老病毒病4的重燃都與蝙蝠有關,如1994年澳大利亞爆發(fā)的亨德拉病毒(Hendra virus)病,1997年澳大利亞爆發(fā)的梅南高病毒(Menangle virus)病,1998年馬來西亞爆發(fā)的尼巴病毒(Nipah virus)病,以及Tioman病毒(Tiomanvirus)病等。 蟲媒病毒(Arbovirus)是導致人類傳染病的重要病原體,我國主要有5種蟲媒病毒傳染病:流行性乙型腦炎(乙型腦炎)、登革熱、腎綜合征出血熱、新疆出血熱和森林腦炎。其中,乙型腦炎與登革熱經(jīng)蚊子傳播,這兩種傳染病的病原體(乙型腦炎病毒和登革病毒)都屬于黃病毒科黃病毒屬(Flavivirus)病毒。黃病毒屬中的西尼羅病毒導致西尼羅熱,也經(jīng)蚊子傳播。西尼羅熱自1999年后,在過去沒有報告過該病的西半球的許多國家發(fā)生爆發(fā)和流行,病死率較高,引起了全球的關注。我國雖然迄今尚沒有報告發(fā)生過西尼羅熱,但地理緯度與美洲流行區(qū)相似,加上日益全球化的問題,存在著發(fā)生該病流行的條件。國外已經(jīng)有研究報道蝙蝠能攜帶乙型腦炎病毒和西尼羅病毒。國內(nèi)學者從云南蝙蝠檢測到乙型腦炎病毒血清抗體,更有人從海南登革熱疫區(qū)蝙蝠中檢測到登革病毒,但都因證據(jù)不足還不足以證實蝙蝠是此兩種病毒的宿主。此外,在我國湖南地區(qū)也從沒有檢測到蝙蝠攜帶乙型腦炎病毒與登革病毒的報道。 因此,了解不同地區(qū)蝙蝠攜帶人類病毒性疾病病原體的本底情況,對于深入認識有關病毒在人與動物進化中的關系,對于科學預防和應對可能爆發(fā)的人獸共患病具有重要的理論和實用意義。本研究擬以湖南省部分地區(qū)為現(xiàn)場,調(diào)查該地區(qū)蝙蝠是否能攜帶乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒這三種蚊媒病毒(mosquito-borne virus)。 研究目的 在湖南部分地區(qū)開展蝙蝠攜帶登革病毒、西尼羅病毒與乙型腦炎病毒的調(diào)查研究,探討蝙蝠作為這些病毒的自然貯存宿主和相關疾病傳染源的可能性。 研究方法 1.調(diào)查地區(qū)的選擇選擇條件為:①便利開展蝙蝠調(diào)查與標本采集:②既往有相關疾病流行。 2.蝙蝠的收集與標本制備 2.1蝙蝠收集在調(diào)查地區(qū)開展現(xiàn)場調(diào)查,了解是否有蝙蝠的棲息、棲息類型以及種類等情況。在不影響蝙蝠活動以及生態(tài)變化的情況下,根據(jù)蝙蝠的棲息地特點采用相應的方法捕捉少量蝙蝠進行研究。 2.2標本制備:收集的蝙蝠經(jīng)鑒定種類后無菌解剖取腦組織。所取得的標本放入1.5ml含RNAlater的凍存管中4℃運輸。腦組織標本用0.1%DEPC水浸泡后高壓消毒過的5ml研磨器加DEPC水無菌研磨至勻漿,3000r/min離心15min,上清即為檢測標本,-70℃保存待檢。 3.病毒分離與鑒定方法 3.1登革病毒 ①參考文獻并引用已得到證實和公認的登革病毒特異性引物和探針,采用Taqman real-time RT-PCR方法對蝙蝠腦組織進行分子生物學檢測。 ②將Taqman real-time RT-PCR判定為登革病毒陽性或可疑為陽性的腦組織上清液接種C6/36細胞,逐日觀察細胞病變并盲傳3代,分離病誨。 ③取細胞液或腦組織上清液腦腔接種1～3d齡的BALB/c乳鼠,觀察乳鼠發(fā)病情況,有可疑發(fā)病者,取腦組織繼續(xù)盲傳3代,如出現(xiàn)規(guī)律發(fā)病者再進行Taqman real-time RT-PCR鑒定。 3.2西尼羅病毒 ①參考文獻并引用已得到證實和公認的西尼羅病毒特異性引物和探針,采用Taqman real-time RT-PCR方法對蝙蝠腦組織進行分子生物學檢測。 ②將Taqman real-time RT-PCR判定為西尼羅病毒陽性或可疑為陽性的腦組織上清液接種BHK-21細胞,逐日觀察細胞病變并盲傳3代,分離病毒。 ③取細胞液或腦組織上清液腦腔接種1～3d齡的BALB/c乳鼠,觀察乳鼠發(fā)病情況,有可疑發(fā)病者,取腦組織繼續(xù)盲傳3代,如出現(xiàn)規(guī)律發(fā)病者再進行Taqman real-time RT-PCR鑒定。 3.3乙型腦炎病毒 ①參考文獻,下載已知乙型腦炎病毒序列進行多序列比對,針對乙型腦炎病毒E基因設計特異性引物,采用普通RT-PCR方法對蝙蝠腦組織進行分子生物學檢測。 ②將RT-PCR判定為乙型腦炎病毒陽性或可疑為陽性的腦組織上清液腦腔接種1～3d齡的BALB/c乳鼠,觀察乳鼠發(fā)病情況,有可疑發(fā)病者,取腦組織繼續(xù)盲傳3代,如出現(xiàn)規(guī)律發(fā)病者再進行RT-PCR鑒定。 ③對PCR產(chǎn)物進行切膠、稱重,經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后,與pGEM-T載體連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α,涂布LB平板,再接種至含AMP 5mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng),取菌液進行基因序列測定,以判斷DNA序列。 ④將測序結果利用ncbi上的BLAST軟件進行在線同源性分析,并從GeneBank中下載其他乙型腦炎病毒序列,利用Clustal W進行多序列比對分析。 4.質(zhì)量控制 ①槍頭、EP管等實驗耗材均為一次性用品。逆轉(zhuǎn)錄過程采用DEPC處理所有容器和配制試劑,以去除RNA酶污染。 ②戴口罩、手套、帽子,在無菌間超凈臺上進行操作,防止試劑和實驗過程受到污染。 ③Taqman real-time RT-PCR、RT-PCR、動物實驗和細胞實驗過程中均設立陽性對照、陰性對照和空白對照。 研究結果 1.蝙蝠基本情況 從2007年4月至2007年9月期間共2次到湖南部分地區(qū)收集蝙蝠。收集了2個科8個種共344只蝙蝠。其中:2個科分別為菊頭蝠科(Rhinolophidae)和蝙螄科(Vespertilionidae);8個種分別為:中菊頭蝠(Rhinolophus affinis)156只、大耳菊頭蝠(Rhinolophus macrotis)2只、中華菊頭蝠(Rhinolophus sinicus)20只、大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)1只、皮氏菊頭蝠(Rhinolophus pearsoni)2只、小菊頭蝠(Rhinolophus blythi)2只、普通長翼蝠(Miniopterus schreibersi)152只、馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum)9只。此研究所收集344只蝙蝠經(jīng)專家鑒定均為食蟲蝙蝠,棲息地主要是房屋的縫隙、屋檐下、被廢棄的房屋罩及旅游景點的山洞等,與人類接觸較密切。 2.蝙蝠攜帶登革病毒的情況 ①從收集到的344只蝙蝠身上獲取了344份腦組織,采用Taqman Real-timeRT-PCR方法檢測出4份登革病毒陽性標本,蝙蝠登革病毒的攜帶率為1.16%。Ct值分別為:28.62、31.36、34.46、34.78;陽性對照Ct值為24.80。陽性樣品中:中華菊頭蝠1例(攜帶率為5%),中菊頭蝠3例(攜帶率為1.92%),其他蝙蝠未查出陽性結果。 ②將上述4份腦組織上清液接種C6/36細胞,逐日觀察細胞病變,未見細胞病變,盲傳3代,仍未能觀察到細胞病變。 ③將4份腦組織上清液接種乳鼠,3d后出現(xiàn)輕微發(fā)病癥狀,由于發(fā)現(xiàn)不及時,乳鼠發(fā)病后過夜全被母鼠吞食掉,再融解上清液繼續(xù)接種,未發(fā)現(xiàn)發(fā)病老鼠。 3.蝙蝠攜帶西尼羅病毒的情況 ①本次實驗利用Taqman Real-time RT-PCR未從344份蝙蝠腦組織標本中檢測出西尼羅病毒陽性標本。 ②將上清液分別接種于1～3d齡的BALB/c乳鼠和BHK-21細胞,均未能分離到西尼羅病毒。 4.蝙蝠攜帶乙型腦炎病毒的情況 ①采用RT-PCR方法從344只蝙蝠腦組織標本中檢測出7份乙型腦炎病毒陽性標本,蝙蝠乙型腦炎病毒的攜帶率為2.04%。其中中菊頭蝠2只,攜帶率為1.28%;普通長翼蝠5只,攜帶率為3.29%,其他種類蝙蝠未檢測出乙型腦炎病毒。 ②將RT-PCR檢測出的7份陽性樣品的上清液接種于1～3d齡的BALB/c乳鼠,3d后開始發(fā)病,乳鼠發(fā)病癥狀為:拒乳、抽搐、側(cè)臥、弓背,8d后全部發(fā)病死亡,成功地分離到乙型腦炎病毒。 ③將PCR產(chǎn)物純化、測序,所得序列與GeneBank上公布的乙型腦炎序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)所得序列與已知的乙型腦炎序列同源性為99%-100%。 結論 1.本研究從所收集344份蝙蝠的腦組織中未能檢測到西尼羅病毒,提示該地區(qū)蝙蝠攜帶西尼羅病毒的幾率不大。但是鑒于本研究的標本量尚不大,且有研究報道蝙蝠和西尼羅病毒存在一定的關系,故還不能肯定地排除該地區(qū)蝙蝠攜帶西尼羅病毒可能性。 2.利用Taqman real-time RT-PCR方法從344份蝙蝠腦組織檢測出登革病毒陽性樣品4份(攜帶率為1.16%);將這4份標本上清液接種乳鼠后發(fā)病,由于發(fā)現(xiàn)不及時,乳鼠發(fā)病后過夜全被母鼠吞食掉,再接種則未成功:將上清液接種細胞也未能成功地分離出登革病毒。雖然由于實驗原因未能分離到登革病毒,但我們也可初步判斷出這幾份陽性樣品中存在登革病毒。 3.利用RT-PCR方法從344份蝙蝠腦組織檢測出乙腦病毒陽性樣品7份(攜帶率為2.04%);將這7份標本接種乳鼠后均能引起發(fā)病甚至死亡;另外序列比對發(fā)現(xiàn)純化所得序列與已知的乙型腦炎序列同源性為99%～100%。證實了國內(nèi)的蝙蝠能攜帶乙型腦炎病毒。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R184;R181.3

【參考文獻】

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本文編號：1709320