本文選題：腎綜合征出血熱　切入點(diǎn)：漢坦病毒　出處：《山東大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 一、研究背景 腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)在我國也被稱作流行性出血熱(Epidemic hemorrhagic fever，EHF)，是由漢坦病毒(Hantavirus，HV)引起的在臨床上以高熱、出血和腎功能損害為特征，嚴(yán)重危害人類健康的自然疫源性疾病。中國是世界上HFRS發(fā)病最高的國家，累計發(fā)病100多萬，每年報告病例占全球90％以上，疫區(qū)發(fā)病率在3.5／10萬左右，流行期間病死率高達(dá)30％，該病在我國分布范圍廣、疫區(qū)類型復(fù)雜，已成為危害人民健康和生命安全的重點(diǎn)傳染病之一。山東省1962年在濟(jì)寧魚臺縣發(fā)現(xiàn)首例病人，隨后病例散在發(fā)生，1975年后疫情呈逐年上升趨勢，，1986年發(fā)病達(dá)最高峰，全年報告發(fā)病41443人，發(fā)病率為53.69／10萬，約占當(dāng)年全國總報告發(fā)病人數(shù)的50％。之后，我省HFRS報告發(fā)病人數(shù)，一直居全國首位，總發(fā)病人數(shù)占全國發(fā)病人數(shù)的1／3。 HFRS在山東每隔10年左右出現(xiàn)一次流行高峰，前兩次流行高峰分別出現(xiàn)在1986年和1995年。按照此規(guī)律，下一個流行高峰可能會在近年出現(xiàn)。研究表明近幾年來山東省HFRS發(fā)病開始出現(xiàn)一些波動，進(jìn)入不穩(wěn)定期。因此有必要對山東省HFRS流行病學(xué)特征進(jìn)行調(diào)查，并在此基礎(chǔ)上對HV分離株基因變異情況等進(jìn)行研究，這將對該病的有效預(yù)防與控制具有重要的意義。 二、研究目的 1．闡明山東省1994-2006年HFRS發(fā)病和死亡病例的時間、地點(diǎn)和人群分布特征。 2．分析山東省HFRS宿主動物的種類構(gòu)成、生態(tài)學(xué)特征、小獸密度和帶毒情況。 3．分析山東省HV核苷酸序列特征及其進(jìn)化關(guān)系，HV亞型分布及其與其它毒株的基因同源性。 4．探討HV快速診斷和基因分型方法。 三、研究方法 1．人間疫情分析山東省1994-2006年HFRS疫情數(shù)據(jù)來自山東省疾病預(yù)防控制中心(CDC)疫情報告資料，利用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，繪制折線圖和柱狀圖，利用地理信息系統(tǒng)(Geographic information systems，GIS)繪制發(fā)病和死亡分布圖。 2．宿主動物分析山東省1994-2006年各固定監(jiān)測點(diǎn)和游動監(jiān)測點(diǎn)小獸密度、小獸種類構(gòu)成和各小獸的帶毒率監(jiān)測資料來自山東省HFRS監(jiān)測點(diǎn)的宿主動物流行病學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果，血清學(xué)和病原學(xué)檢測在山東省CDC的HFRS實(shí)驗(yàn)室完成。利用Excel和SPSS11.5軟件對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算小獸密度、種群構(gòu)成、群落空間分布和感染病毒情況。 3．分子流行病學(xué)研究 3．1鼠肺和部分病人血清HV抗原檢測利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(Indirect immunofluorescent assay, IFA)檢測。 3．2部分病人血清HV IgM抗體檢測利用IgM捕獲ELISA法(MacELISA)。 3．3 RNA提取利用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病人血清和經(jīng)IFA檢測為陽性鼠肺的總RNA。 3．4逆轉(zhuǎn)錄套式PCR(Reverse transcription nested PCR，RT Nested PCR)將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)HV基因M片段G2區(qū)保守序列合成1對通用外引物和兩對型特異性引物，首先以合成的cDNA為模板，利用通用外引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，然后以其產(chǎn)物為模板，分別用兩對型特異性引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。 3．5序列測定將第二次PCR產(chǎn)物利用試劑盒回收，回收產(chǎn)物送上海英俊生物技術(shù)有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司利用377DNA測序儀器進(jìn)行序列測定。 3．6同源性分析與系統(tǒng)發(fā)生樹研究利用DNASTAR軟件將測序所得序列和山東以往HV序列以及國、內(nèi)外其它地區(qū)HV序列進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)發(fā)生樹分析。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果，將所有山東地區(qū)HV序列按亞型在山東省地形圖上進(jìn)行標(biāo)注、分析。將山東省鼠源毒株序列和人源毒株序列分別進(jìn)行同源性比較，采用t檢驗(yàn)將其同源性數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。 3．7 PCR／SSCP根據(jù)漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)HTN76-118株和漢城病毒(Seoul virus，SEOV)SR-11株S基因片段序列資料設(shè)計互補(bǔ)于S基因片段的一對寡核苷酸引物(內(nèi)、外引物各一對)，對從病人血清中提取的總RNA利用內(nèi)、外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將第二次PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-strand conformation polymorphism，SSCP)分析。 四、主要研究結(jié)果 1．人間疫情1994-2006年山東省HFRS發(fā)病呈現(xiàn)下降趨勢，發(fā)病和死亡都有明顯的春季和秋冬季高峰，近年來發(fā)病和死亡秋峰略有升高且出現(xiàn)時間略有提前，自2003年起病死率明顯上升，2005年達(dá)到1.11％。山東省HFRS主要發(fā)生在魯中南山區(qū)，2001-2006年與1994-2000年相比，魯東南丘陵地區(qū)所占比例有所增加，魯西北平原所占比例則明顯下降。1995-2006年山東省HFRS發(fā)病男性占67.21％，女性占32.79％，性別比例為2.05：1；死亡病例中男性占71.82％，女性占28.18％，性別比例為2.55：1，近年來男性發(fā)病稍有增高，而女性死亡有所增高。山東省HFRS以20-59歲人群發(fā)病為高，占全部發(fā)病的79.61％，近年來50歲以上年齡組人群發(fā)病和死亡所占比例升高。各種職業(yè)中，農(nóng)民發(fā)病和死亡最多，分別占81.55％和82.84％。 2．宿主動物1994-2006年山東省居民區(qū)主要以褐家鼠(59.58％)和小家鼠(32.39％)為優(yōu)勢鼠種，野外主要以黑線姬鼠(32.39％)、褐家鼠(26.65％)和大倉鼠(22.68％)為優(yōu)勢鼠種，居民區(qū)和野外鼠種構(gòu)成有顯著性差異(χ~2=3356.588，P=0.000)。分1994-2000和2001-2006時間段來看，2001-2006年居民區(qū)小家鼠所占比例上升，褐家鼠下降，而野外黑線姬鼠比例下降，褐家鼠比例上升。從生態(tài)群落空間分布來看，魯中南山區(qū)群落的多樣性(0.6870)最高，魯東南丘陵地區(qū)群落的均勻度(0.7038)最高，膠萊平原的多樣性(0.4337)和均勻度(0.4949)均最低。1994-2006年共檢測9種9848只動物，肺HV抗原陽性318只，小獸帶毒率為3.23％，其中褐家鼠225只，占70.75％；小家鼠42只，占13.21％；黑線姬鼠29只，占9.12％；大倉鼠10只，占3.14％；背紋倉鼠和

本文編號：1700733