本文選題：戊型肝炎病毒　切入點(diǎn)：跨種間傳播　出處：《上海交通大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的經(jīng)腸道傳播的急性病毒性肝炎。中國已被列為因HE發(fā)病和死亡所致的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最嚴(yán)重的國家之一。越來越多的報(bào)道顯示HE是一種人獸共患病,可以跨種間感染與傳播�，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)對(duì)HEV易感的動(dòng)物包括豬、非人靈長類、野鹿、牛、山羊、馬等。豬等家養(yǎng)動(dòng)物與人類接觸密切,攜帶有HEV的這些動(dòng)物很有可能通過密切接觸而傳染給人類,給公共衛(wèi)生構(gòu)成很大威脅。開展HE的病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)理等方面的研究具有重要意義。 HE的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展,但還存在很多問題。(1)我國HEV分子流行病學(xué)雖然已經(jīng)開展了許多研究,但是很多地區(qū)的相關(guān)研究尚屬空白。而且由于HEV的流行還受地理環(huán)境及當(dāng)?shù)厝嗣裆盍?xí)慣等因素的影響,不同地區(qū)HEV的流行特征不盡相同。因此我國部分地區(qū)的HEV分子流行病學(xué)調(diào)查還有待開展。(2)HEV的天然宿主較多,除了家養(yǎng)動(dòng)物豬之外,野生動(dòng)物的HEV攜帶情況也值得重視,然而我國對(duì)HEV的野生動(dòng)物宿主研究較少。(3) HEV跨種間傳播分子機(jī)制仍不清楚,因此亟待找到人或動(dòng)物細(xì)胞表面HEV的受體分子,為防控HEV跨種間感染與傳播提供理論借鑒。(4)HEV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制研究仍然是空白。 有鑒于此,本研究主要從HE的分子流行病學(xué)、HEV與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制等方面開展研究,結(jié)果如下: 一:HE的分子流行病學(xué)研究 (1)野生動(dòng)物中HEV攜帶情況調(diào)查 從上海及安徽地區(qū)的2個(gè)野生動(dòng)物園采集了191份野生動(dòng)物糞便樣品。通過RT-nPCR方法檢測樣品中的HEV RNA。結(jié)果表明,上海地區(qū)的野生動(dòng)物未檢測到HEV的存在,而在安徽某野生動(dòng)物園的38份樣品中,有11份為HEV RNA陽性。序列分析表明該11個(gè)毒株均為基因4型,序列之間的同源性為96-100%,推測在該野生動(dòng)物園的不同種野生動(dòng)物之間發(fā)生了HEV的跨種間傳播。盡管從該野生動(dòng)物園采集的7份工作人員血清終未檢測到HEV RNA的存在,但HEV抗體的ELISA檢測表明,其中有5人為HEV抗體IgG或IgM陽性。說明該野生動(dòng)物園中的人也可能受到了HEV的感染。 (2)皖北地區(qū)人群及豬群HEV分子流行病學(xué)研究 從皖北蘇魯豫皖交界地區(qū)的阜陽市、淮北市及宿州市采集了1476份人普通人血清,正常豬群554份糞便樣品。血清樣品用ELISA檢測HEV抗體IgG及IgM, HEV抗體陽性的血清和豬糞便樣品通過RT-nPCR方法檢測HEV RNA。為了檢驗(yàn)人血清中HEV抗體與豬群HEV毒株的反應(yīng)性,通過Dot-Blot方法驗(yàn)證了20份IgG陽性及9份IgM陽性的人血清樣品與2株豬HEV代表毒株的反應(yīng)。結(jié)果顯示,皖北地區(qū)普通人群HEV抗體的總陽性率為7.93%(117/1476);HEV在血清中的陽性率為0.95%(14/1476);正常豬群中HEV病毒攜帶率為7.0%(39/554)。14個(gè)人HEV毒株及39個(gè)豬HEV毒株經(jīng)過測序后進(jìn)行基于核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果顯示該53個(gè)毒株均屬于基因4型HEV,聚類為3個(gè)群;39個(gè)豬源HEV分成2個(gè)群,而14個(gè)人HEV毒株單獨(dú)聚為1個(gè)群。由此推測該地區(qū)豬源HEV毒株不是人感染HE的感染源。本研究還克隆了該地區(qū)2株豬源及1株人源HEV代表毒株的病毒外殼蛋白全基因序列。序列分析顯示,該3株HEV外殼蛋白基因全長均為2025bp,編碼674個(gè)aa�；诓《就鈿さ鞍谆虻南到y(tǒng)進(jìn)化分析顯示3個(gè)毒株并聚類在3個(gè)不同的亞群之中,說明有3個(gè)不同的HEV毒株同時(shí)在皖北地區(qū)流行。 (3)華東地區(qū)幾株HEV毒株遺傳特征分析 本研究對(duì)兒童糞便樣品中分離的1株HEV毒株、上海某馬場分離的1株基因3型HEV毒株、上海市豬群流行的HEV代表毒株進(jìn)行了序列分析。另外結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室分離的10株代表毒株,檢索了GenBank中57株其他國家或地區(qū)代表毒株,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析以闡明華東地區(qū)HEV毒株與它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明,(1)本研究從236份兒童糞便樣品中檢測到1株HEV,克隆了該毒株外殼蛋白基因全長,系統(tǒng)金華分析表明該毒株為基因4型,與1株日本毒株AB197673親緣關(guān)系最近,同源性為97%。(2)中國4個(gè)不同省/市發(fā)現(xiàn)基因3型HEV在豬群中流行。2007年中國上海地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)基因3型HEV以來,本研究對(duì)來自河南、安徽、上海的豬群進(jìn)行HEV基因3檢測,發(fā)現(xiàn)基因3型不僅在上海豬群中流行,還在安徽及河南的豬群流行;同時(shí)GenBank中有研究者提交基因3型HEV序列,本研究對(duì)這些序列分析發(fā)現(xiàn)中國大陸地區(qū)的基因3型HEV與日本基因3型HEV毒株親緣關(guān)系最近。(3)對(duì)上海市豬群HEV代表毒株的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn),該毒株的基因編碼方式與以前的基因4型HEV不一樣,而與基因3型HEV編碼方式相同,即外殼蛋白編碼660個(gè)aa,而不是674個(gè)aa。該結(jié)果被Western Blot進(jìn)一步證實(shí)。 二:HEV與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制的初步探索 (1)豬肝細(xì)胞表面HEV候選受體蛋白的鑒定 本實(shí)驗(yàn)利用VOPBA技術(shù)鑒定豬胃、十二指腸、肺、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)、腎臟及脾臟組織細(xì)胞表面HEV候選受體。結(jié)果表明在肝組織及胃組織表面有一條約55kDa的目的條帶,該蛋白條帶純化后可以顯著阻斷HEV對(duì)易感細(xì)胞A549的產(chǎn)生的細(xì)胞病變。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明該蛋白條帶成分復(fù)雜,推測其中內(nèi)在膜蛋白2B、膜突蛋白-B、ATP合成酶肝臟異構(gòu)體及細(xì)胞色素P450有可能是HEV的候選受體。 (2)肝cDNA文庫中與HEV pORF3互作蛋白的篩選 HEV ORF3編碼一個(gè)磷酸化蛋白,但是在HEV感染宿主細(xì)胞中行使的具體的功能尚不明確,本研究利用CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng),以pORF3作為誘餌蛋白,在人肝cDNA表達(dá)文庫中篩選與HEV pORF3相互作用蛋白。結(jié)果從肝cDNA表達(dá)文庫中篩選到了10個(gè)與HEV pORF3相互作用蛋白,為進(jìn)一步研究pORF3在HEV感染宿主細(xì)胞中的功能奠定了一定的基礎(chǔ)。 (3)HEV感染A549細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 本研究利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定比較了HEV感染A549細(xì)胞與對(duì)照攻毒細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異。HEV感染A549細(xì)胞后,經(jīng)細(xì)胞病變觀察、Dot-blot、RT-nPCR、免疫電鏡驗(yàn)證HEV病毒感染細(xì)胞后,提取細(xì)胞總蛋白,雙向電泳分離試驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞總蛋白,分析蛋白點(diǎn)的差異。結(jié)果表明HEV感染試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞總蛋白共有31個(gè)顯著差異點(diǎn),其中21個(gè)點(diǎn)在HEV感染A549細(xì)胞中表達(dá)豐度降低,10個(gè)點(diǎn)在HEV感染A549細(xì)胞中表達(dá)豐度升高。質(zhì)譜鑒定表明31個(gè)點(diǎn)中的28個(gè)點(diǎn)有可靠的肽指紋圖譜及可信搜庫結(jié)果,這些蛋白包括代謝相關(guān)蛋白為9個(gè),細(xì)胞骨架蛋白6個(gè),細(xì)胞內(nèi)大分子處理類蛋白6個(gè),細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成份2個(gè),膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白3個(gè),細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白1個(gè),病毒外殼蛋白點(diǎn)1個(gè)。RT-nPCR方法檢測其中27個(gè)宿主細(xì)胞基因在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照攻毒細(xì)胞內(nèi)mRNA水平的表達(dá)差異,結(jié)果表明15個(gè)基因有有效PCR擴(kuò)增結(jié)果,其中8個(gè)與比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。從27個(gè)蛋白點(diǎn)中選擇1個(gè)表達(dá)上調(diào)和1個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白用Western Blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證,顯示與比較蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。說明比較蛋白質(zhì)學(xué)結(jié)果可信。由此推測,HEV感染細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞代謝減緩并抑制了細(xì)胞骨架的組裝,為病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制創(chuàng)造有利條件。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R512.6;R181.3

【引證文獻(xiàn)】

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1 穆亞芳;兔出血癥病毒VP60蛋白與膜突蛋白相互作用的鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

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本文編號(hào)：1698736