本文關(guān)鍵詞：杯狀病毒分子流行病學(xué)及病原與宿主互作機(jī)制研究　出處：《上海交通大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 杯狀病毒 分子流行病學(xué) 病毒基因組 基因重組 動(dòng)物模

【摘要】：杯狀病毒科(Caliciviridae)包含4個(gè)屬,分別為:諾如病毒(Norovirus,NoV)、札幌病毒(Sapovirus,SaV)、囊病毒(Vesivirus)及兔出血熱病毒(Lagovirus)。屬單股正鏈RNA病毒,直徑約27-40nm,無包膜,衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。杯狀病毒科中NoV和SaV為主要的醫(yī)學(xué)病原,均能引發(fā)急性胃腸炎;而囊病毒和兔出血熱病毒為動(dòng)物源性病原,其中的貓杯狀病毒和兔出血熱病毒分別引發(fā)貓呼吸系統(tǒng)疾病和兔的致命性出血性疾病。 NoV是導(dǎo)致人急性腸胃炎的最主要的非細(xì)菌性感染源之一,經(jīng)常導(dǎo)致家庭和社區(qū)性的爆發(fā)流行;而SaV致病性較弱,感染率較低,主要感染對象為嬰幼兒。除了人群,NoV和SaV也在豬、鼠、水貂等多種動(dòng)物里被檢測到,這也引發(fā)了二者是否均為人畜共患病病原的討論。 杯狀病毒的研究起步較晚,雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但還存在很多問題有待解決。 1中國人及豬杯狀病毒分子生物學(xué)研究 我國人杯狀病毒的研究起步較晚,1995年才首次開始研究,實(shí)際上,在我國大部分地區(qū)都存在該病毒的感染和發(fā)病,過去由于未列入常規(guī)檢測項(xiàng)目或報(bào)告項(xiàng)目,對該病毒感染和發(fā)病的狀況不甚了解。因此有必要對我國的人杯狀病毒分子流行病學(xué)情況進(jìn)行系統(tǒng)研究。 除了流行病學(xué)特性,對我國諾如病毒的分子生物學(xué)特征,例如病毒的全基因結(jié)構(gòu)、重組和進(jìn)化等方面還知之甚少。另外,我國動(dòng)物群體中特別是跟人類關(guān)系密切的豬群中的杯狀病毒的流行情況等基本處于空白。而越來越多的證據(jù)顯示,杯狀病毒存在著跨種間傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此,動(dòng)物源杯狀病毒的研究對人杯狀病毒的防控,預(yù)警機(jī)制建立等都具有重要意義。目前我國對札幌病毒的重視程度不夠,流行病學(xué)情況、分子生物學(xué)特征、致病機(jī)制及危害、病毒進(jìn)化與重組等了解不多,因此,對以上各方面均有必要進(jìn)行深入研究。 2致病機(jī)理與動(dòng)物模型 目前對杯狀病毒的研究主要集中于流行病學(xué)研究,對病毒的感染、致病機(jī)制,物種與組織嗜性,靶細(xì)胞受體,在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程等基礎(chǔ)研究相對較少。由于杯狀病毒除極個(gè)別毒株外一般都難以體外培養(yǎng),極大地制約了相關(guān)研究的進(jìn)展。而動(dòng)物模型是研究致病機(jī)理的有效手段之一。因此,采用動(dòng)物模型模擬疾病的發(fā)生對杯狀病毒感染、致病機(jī)制乃至跨種間傳播預(yù)測等具有重要意義。 3 SaV的受體研究 病毒受體是公認(rèn)的引發(fā)病毒感染宿主細(xì)胞的主要決定因素,也是影響病毒宿主特異性和組織親嗜性的決定因素之一。因此,鑒定SaV受體及其特性與功能,對于從分子水平闡明病毒感染與免疫的機(jī)制,深刻理解病毒與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系,病毒的跨種間感染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測,疫苗、診斷試劑的研制等,都具有重大的理論與實(shí)踐意義。有研究顯示,人諾如病毒的受體可能為人類血型組織抗原(histo-blood group antigens,HBGA)。為鑒定SaV的受體是否也為HBGA,Jiang等采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人源SaV的病毒樣顆粒,并測試了它們之間的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些病毒樣顆粒不能與HBGA結(jié)合,從而排除了HBGA作為SaV受體的可能性。目前,札幌病毒的受體依然未知。 有鑒于此,本研究主要從杯狀病毒的分子流行病學(xué)、動(dòng)物模型建立、病毒樣顆粒的表達(dá)、病毒與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制等方面開展研究, 結(jié)果如下: 一杯狀病毒的分子流行病學(xué)研究 1中國大陸發(fā)現(xiàn)豬SaV導(dǎo)致仔豬腹瀉 2008年2月上海郊區(qū)某規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場發(fā)生仔豬腹瀉,兩窩仔豬中7只仔豬發(fā)生,剩余12只仔豬正常。采集上述腹瀉糞便樣品和正常仔豬糞便樣品,同時(shí)從該豬場和鄰近豬場分別采集正常糞便標(biāo)本20和80份。根據(jù)腹瀉仔豬癥狀和糞便外觀觀察,初步排除常見細(xì)菌性腹瀉可能。通過PCR或RT-PCR檢測了PCV、PRC、TGEV、PEDV、豬NoV和豬SaV等常見或者新發(fā)的能夠?qū)е伦胸i腹瀉的病毒。結(jié)果顯示,除SaV為,其它病毒均為陰性。為證實(shí)仔豬腹瀉是否由SaV感染引起,我們進(jìn)行了動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,豬SaV病毒陽性糞便懸液能夠?qū)е伦胸i腹瀉和嘔吐,并且能夠在實(shí)驗(yàn)組仔豬的糞便樣品中持續(xù)檢測到病毒。 2華東地區(qū)豬杯狀病毒分子流行病學(xué)研究 到目前為止,各國豬群中尚無關(guān)于杯狀病毒的系統(tǒng)性研究。為研究豬群中杯狀病毒的感染情況,本實(shí)驗(yàn)從中國華東地區(qū)(上海、江蘇、安徽)采集豬新鮮糞便樣品,進(jìn)行分子流行病學(xué)檢測和分子系統(tǒng)進(jìn)化分析,并對不同月齡的感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示,中國豬群中存在上述兩種病毒的感染,SaV和NoV的感染率分別為0.9%(8/904)和0.2%(2/904)。序列分析顯示,豬SaV分離株均屬GIII,并可進(jìn)一步分為兩個(gè)遺傳簇。它們分別與荷蘭和韓國的豬SaV分離株同源性最近,這暗示,它們可能分別與這兩個(gè)毒株有著相同的遺傳起源。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,小于1月齡的仔豬的感染率顯著高于1月齡以上的豬的感染率(P0.05)。本研究表明,中國華東地區(qū)豬群中存在豬NoV的感染,但感染率很低,并非該地區(qū)的主要病毒性感染源。 3貴州地區(qū)豬杯狀病毒和戊型肝炎病毒分子流行病學(xué)研究 為研究我國西南地區(qū)的杯狀病毒和戊型肝炎病毒(HEV)的分子流行情況,2009年5-6月,從貴州省6個(gè)規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場隨機(jī)采集豬新鮮糞便樣品209份,用RT-PCR方法進(jìn)行上述病毒的檢測和分子進(jìn)化分析。HEV和SaV的豬場陽性率分別為83%(5/6)和33%(2/6),未檢測到NoV。另外,未發(fā)現(xiàn)HEV和SaV共感染。HEV和豬SaV的總體陽性率分別為6.7%(15/209)和1.0% (2/209)。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,這10株HEV毒株均為G4。它們之間的核酸同源性為90%-99%,與鄰近省份廣西的一株人HEV分離株(AF103940)聚為一支,同源性為92%-%94%。兩株SaV均為GIII,它們之間的核酸同源性為96%,與一支巴西分離株同源性最高(91%),與中國華東地區(qū)的分離株(FJ374683)同源性只有82%-84%。這表明,盡管感染率較低,但貴州地區(qū)的豬群中存在豬SaV的感染。 4中國豬SaV代表毒株全基因組分析 研究顯示有些毒株(如Sapovirus pig/43/06-18p3/06/ITA)在序列上與人的SaV毒株非常接近,這提示豬SaV有可能是人SaV感染的病原之一。為研究中國豬SaV毒株的分子生物學(xué)特征,對首支中國分離株進(jìn)行了全基因組克隆與分析。結(jié)果表明,該毒株(Ch-sw-sav1)基因組序列不含3′poly(A)結(jié)構(gòu)全長為7541 nt, A、C、G、U的所占的比重分別為19%、14.3%、33.3%和33.3%。5′末端含有典型的GTG結(jié)構(gòu)。ORF1含有6765 nt(2255aa),編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和外殼蛋白VP1(544aa)。ORF2長度為516 nt,編碼172 aa的小的外殼蛋白VP2(圖1A)。ORF1編碼的多聚蛋白包括2C解螺旋酶(2C helicase,GPPGIGKT),3C蛋白酶(3C protease,GDCG),RdRp(GLPSG和YGDD),這些非結(jié)構(gòu)蛋白在所有杯狀病毒中均高度保守。在VP1區(qū)中同樣含有PPG模塊。基于全基因組序列的分析顯示,本毒株屬于GIII SaV�；贠RF2 3′末端的對比結(jié)果顯示,本分離株含有一個(gè)21 nt插入片段。 5上海地區(qū)門診兒童的人杯狀病毒感染情況調(diào)查及基因重組分析 本研究從上海某三甲醫(yī)院采集門診兒童糞便樣品452份,用RT-PCR方法檢測人杯狀病毒的感染情況,并對陽性毒株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。選取代表性毒株進(jìn)行全基因組克隆,用相關(guān)軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和重組分析。452份兒童糞便樣品中有20份呈NoV RNA陽性,總體陽性率為4.4%,無SaV陽性糞樣檢出。20份NoV陽性樣品的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示20個(gè)毒株中19株序列彼此不完全相同。它們之間的同源性為79.5%-98.8%。進(jìn)化分析顯示,這19株序列均為GII,并聚集為3個(gè)遺傳簇(clusters)。其中兩個(gè)遺傳簇為GII-4,另外一個(gè)為GII-3。為分析這些毒株的分子特征,從3個(gè)遺傳簇中分別選取一個(gè)代表性毒株進(jìn)行全基因組克隆和基因重組分析。結(jié)果證明,HU/GII/SHANGHAI/SH312/2008/CHN毒株為重組毒株。 二豬SaV小型豬感染模型的建立 本研究采用分離的豬SaV中國株Ch-sw-sav1為攻毒株,通過口服感染SPF級(jí)巴馬小型豬,通過收集感染后臨床癥狀、病理變化的相關(guān)信息以及各組織器官中病原的RT-PCR檢測,掌握豬SaV感染豬的第一手資料,為疾病感染機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,攻毒后第二天實(shí)驗(yàn)組豬即出現(xiàn)不同程度腹瀉,個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象。剖檢結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組豬出現(xiàn)腹脹、小腸出血現(xiàn)象。病理切片的光鏡檢測結(jié)果表明:小腸絨毛萎縮、脫落;透射電鏡顯微觀測表明:小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞核或線粒體病變。間接免疫熒光顯示,在小腸各段能檢測到病毒抗原的存在。血常規(guī)檢測結(jié)果顯示,與對照組和空白組相比,實(shí)驗(yàn)組豬在攻毒后白細(xì)胞上升,第14天達(dá)到最高值,隨后開始下降;血小板在攻毒第21天急劇上升,然后緩慢下降;與對照組和空白組相比,實(shí)驗(yàn)組豬紅細(xì)胞沒有明顯變化。RT-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組豬從攻毒第二天即開始排毒,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(PID36)。 三豬SaV靶細(xì)胞受體初步研究 1連接黏附分子1作為豬SaV受體的可能性研究 杯狀病毒中的NoV和貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)的功能性受體分別為人類血型組織抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)和連接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1,JAM-1)。已有的研究數(shù)據(jù)均顯示識(shí)別碳水化合物可能是杯狀病毒的共同特征,盡管在長期的進(jìn)化過程中不同杯狀病毒已適應(yīng)了不同的宿主細(xì)胞。對此,研究人員分別測試了NoV和SaV與HBGAs間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,NoV的VLPs能夠與HBGAs結(jié)合,而SaV GI和GV的VLPs均不能結(jié)合HBGAs。為檢驗(yàn)JAM-1作為GIII SaV受體的可能性,我們測試了抗JAM-1多抗對SaV病毒感染易感細(xì)胞LLC-PK的阻斷效果。在病毒感染細(xì)胞前用不同濃度抗JAM-1多抗預(yù)先與細(xì)胞孵育,隨后用熒光定量PCR方法檢測不同濃度抗體的孵育能否阻斷或者降低病毒對細(xì)胞的結(jié)合和感染。結(jié)果顯示,JAM-1抗體不能阻斷或者降低SaV對易感細(xì)胞LLC-PK的感染。這表明,JAM-1作為SaV感染宿主細(xì)胞的受體可能性較低。 2 VOPBA和Co-IP法篩選豬SaV候選受體 本研究擬采用VOPBA法和免疫共沉淀法結(jié)合質(zhì)譜探索豬SaV在易感細(xì)胞LLC-PK細(xì)胞表面受體;采用上述兩種方法共鑒定到若干疑似蛋白。根據(jù)這些蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布和功能結(jié)合文獻(xiàn)分析,選取MHC-1(major histocompatibility complex class I)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。CO-IP結(jié)果顯示,MHC-I能夠與病毒結(jié)合。 四人NoV病毒樣顆粒(Virus-like particles)表達(dá) 本研究采用桿狀病毒表達(dá)載體進(jìn)行GII-4和GII-12毒株的VLPs表達(dá),并用Western-blot和免疫電鏡方法進(jìn)行抗原性和形態(tài)學(xué)鑒定;嘗試將外殼蛋白VP1和綠色熒光蛋白(EGFP)融合表達(dá),以期得到帶有EGFP標(biāo)記的病毒樣顆粒。研究結(jié)果顯示,所有的重組桿狀病毒均能在Sf9細(xì)胞中表達(dá)。除了與EGFP融合的蛋白不能成功純化外,其它均能得到合適濃度的重組蛋白。Western-blot和免疫電鏡顯示,這些蛋白均具有抗原性并能自我組織形成病毒樣顆粒,而GII-12的VLPs能夠被抗GII-4 VLPs的抗體所識(shí)別。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R181.3

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 莊金秋;梅建國;沈志強(qiáng);;水貂杯狀病毒生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年03期

，

本文編號(hào)：1354976