本文關(guān)鍵詞：杯狀病毒分子流行病學及病原與宿主互作機制研究　出處：《上海交通大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：杯狀病毒科(Caliciviridae)包含4個屬,分別為:諾如病毒(Norovirus,NoV)、札幌病毒(Sapovirus,SaV)、囊病毒(Vesivirus)及兔出血熱病毒(Lagovirus)。屬單股正鏈RNA病毒,直徑約27-40nm,無包膜,衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。杯狀病毒科中NoV和SaV為主要的醫(yī)學病原,均能引發(fā)急性胃腸炎;而囊病毒和兔出血熱病毒為動物源性病原,其中的貓杯狀病毒和兔出血熱病毒分別引發(fā)貓呼吸系統(tǒng)疾病和兔的致命性出血性疾病。 NoV是導致人急性腸胃炎的最主要的非細菌性感染源之一,經(jīng)常導致家庭和社區(qū)性的爆發(fā)流行;而SaV致病性較弱,感染率較低,主要感染對象為嬰幼兒。除了人群,NoV和SaV也在豬、鼠、水貂等多種動物里被檢測到,這也引發(fā)了二者是否均為人畜共患病病原的討論。 杯狀病毒的研究起步較晚,雖然已經(jīng)取得了很大的進展,但還存在很多問題有待解決。 1中國人及豬杯狀病毒分子生物學研究 我國人杯狀病毒的研究起步較晚,1995年才首次開始研究,實際上,在我國大部分地區(qū)都存在該病毒的感染和發(fā)病,過去由于未列入常規(guī)檢測項目或報告項目,對該病毒感染和發(fā)病的狀況不甚了解。因此有必要對我國的人杯狀病毒分子流行病學情況進行系統(tǒng)研究。 除了流行病學特性,對我國諾如病毒的分子生物學特征,例如病毒的全基因結(jié)構(gòu)、重組和進化等方面還知之甚少。另外,我國動物群體中特別是跟人類關(guān)系密切的豬群中的杯狀病毒的流行情況等基本處于空白。而越來越多的證據(jù)顯示,杯狀病毒存在著跨種間傳播的風險。因此,動物源杯狀病毒的研究對人杯狀病毒的防控,預警機制建立等都具有重要意義。目前我國對札幌病毒的重視程度不夠,流行病學情況、分子生物學特征、致病機制及危害、病毒進化與重組等了解不多,因此,對以上各方面均有必要進行深入研究。 2致病機理與動物模型 目前對杯狀病毒的研究主要集中于流行病學研究,對病毒的感染、致病機制,物種與組織嗜性,靶細胞受體,在細胞內(nèi)的復制過程等基礎(chǔ)研究相對較少。由于杯狀病毒除極個別毒株外一般都難以體外培養(yǎng),極大地制約了相關(guān)研究的進展。而動物模型是研究致病機理的有效手段之一。因此,采用動物模型模擬疾病的發(fā)生對杯狀病毒感染、致病機制乃至跨種間傳播預測等具有重要意義。 3 SaV的受體研究 病毒受體是公認的引發(fā)病毒感染宿主細胞的主要決定因素,也是影響病毒宿主特異性和組織親嗜性的決定因素之一。因此,鑒定SaV受體及其特性與功能,對于從分子水平闡明病毒感染與免疫的機制,深刻理解病毒與宿主細胞的相互關(guān)系,病毒的跨種間感染風險預測,疫苗、診斷試劑的研制等,都具有重大的理論與實踐意義。有研究顯示,人諾如病毒的受體可能為人類血型組織抗原(histo-blood group antigens,HBGA)。為鑒定SaV的受體是否也為HBGA,Jiang等采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了人源SaV的病毒樣顆粒,并測試了它們之間的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些病毒樣顆粒不能與HBGA結(jié)合,從而排除了HBGA作為SaV受體的可能性。目前,札幌病毒的受體依然未知。 有鑒于此,本研究主要從杯狀病毒的分子流行病學、動物模型建立、病毒樣顆粒的表達、病毒與宿主細胞的互作機制等方面開展研究, 結(jié)果如下: 一杯狀病毒的分子流行病學研究 1中國大陸發(fā)現(xiàn)豬SaV導致仔豬腹瀉 2008年2月上海郊區(qū)某規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場發(fā)生仔豬腹瀉,兩窩仔豬中7只仔豬發(fā)生,剩余12只仔豬正常。采集上述腹瀉糞便樣品和正常仔豬糞便樣品,同時從該豬場和鄰近豬場分別采集正常糞便標本20和80份。根據(jù)腹瀉仔豬癥狀和糞便外觀觀察,初步排除常見細菌性腹瀉可能。通過PCR或RT-PCR檢測了PCV、PRC、TGEV、PEDV、豬NoV和豬SaV等常見或者新發(fā)的能夠?qū)е伦胸i腹瀉的病毒。結(jié)果顯示,除SaV為,其它病毒均為陰性。為證實仔豬腹瀉是否由SaV感染引起,我們進行了動物回歸實驗。動物實驗結(jié)果表明,豬SaV病毒陽性糞便懸液能夠?qū)е伦胸i腹瀉和嘔吐,并且能夠在實驗組仔豬的糞便樣品中持續(xù)檢測到病毒。 2華東地區(qū)豬杯狀病毒分子流行病學研究 到目前為止,各國豬群中尚無關(guān)于杯狀病毒的系統(tǒng)性研究。為研究豬群中杯狀病毒的感染情況,本實驗從中國華東地區(qū)(上海、江蘇、安徽)采集豬新鮮糞便樣品,進行分子流行病學檢測和分子系統(tǒng)進化分析,并對不同月齡的感染率進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,中國豬群中存在上述兩種病毒的感染,SaV和NoV的感染率分別為0.9%(8/904)和0.2%(2/904)。序列分析顯示,豬SaV分離株均屬GIII,并可進一步分為兩個遺傳簇。它們分別與荷蘭和韓國的豬SaV分離株同源性最近,這暗示,它們可能分別與這兩個毒株有著相同的遺傳起源。統(tǒng)計結(jié)果顯示,小于1月齡的仔豬的感染率顯著高于1月齡以上的豬的感染率(P0.05)。本研究表明,中國華東地區(qū)豬群中存在豬NoV的感染,但感染率很低,并非該地區(qū)的主要病毒性感染源。 3貴州地區(qū)豬杯狀病毒和戊型肝炎病毒分子流行病學研究 為研究我國西南地區(qū)的杯狀病毒和戊型肝炎病毒(HEV)的分子流行情況,2009年5-6月,從貴州省6個規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場隨機采集豬新鮮糞便樣品209份,用RT-PCR方法進行上述病毒的檢測和分子進化分析。HEV和SaV的豬場陽性率分別為83%(5/6)和33%(2/6),未檢測到NoV。另外,未發(fā)現(xiàn)HEV和SaV共感染。HEV和豬SaV的總體陽性率分別為6.7%(15/209)和1.0% (2/209)。進化分析結(jié)果顯示,這10株HEV毒株均為G4。它們之間的核酸同源性為90%-99%,與鄰近省份廣西的一株人HEV分離株(AF103940)聚為一支,同源性為92%-%94%。兩株SaV均為GIII,它們之間的核酸同源性為96%,與一支巴西分離株同源性最高(91%),與中國華東地區(qū)的分離株(FJ374683)同源性只有82%-84%。這表明,盡管感染率較低,但貴州地區(qū)的豬群中存在豬SaV的感染。 4中國豬SaV代表毒株全基因組分析 研究顯示有些毒株(如Sapovirus pig/43/06-18p3/06/ITA)在序列上與人的SaV毒株非常接近,這提示豬SaV有可能是人SaV感染的病原之一。為研究中國豬SaV毒株的分子生物學特征,對首支中國分離株進行了全基因組克隆與分析。結(jié)果表明,該毒株(Ch-sw-sav1)基因組序列不含3′poly(A)結(jié)構(gòu)全長為7541 nt, A、C、G、U的所占的比重分別為19%、14.3%、33.3%和33.3%。5′末端含有典型的GTG結(jié)構(gòu)。ORF1含有6765 nt(2255aa),編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和外殼蛋白VP1(544aa)。ORF2長度為516 nt,編碼172 aa的小的外殼蛋白VP2(圖1A)。ORF1編碼的多聚蛋白包括2C解螺旋酶(2C helicase,GPPGIGKT),3C蛋白酶(3C protease,GDCG),RdRp(GLPSG和YGDD),這些非結(jié)構(gòu)蛋白在所有杯狀病毒中均高度保守。在VP1區(qū)中同樣含有PPG模塊�；谌蚪M序列的分析顯示,本毒株屬于GIII SaV�；贠RF2 3′末端的對比結(jié)果顯示,本分離株含有一個21 nt插入片段。 5上海地區(qū)門診兒童的人杯狀病毒感染情況調(diào)查及基因重組分析 本研究從上海某三甲醫(yī)院采集門診兒童糞便樣品452份,用RT-PCR方法檢測人杯狀病毒的感染情況,并對陽性毒株進行系統(tǒng)進化分析。選取代表性毒株進行全基因組克隆,用相關(guān)軟件進行系統(tǒng)進化和重組分析。452份兒童糞便樣品中有20份呈NoV RNA陽性,總體陽性率為4.4%,無SaV陽性糞樣檢出。20份NoV陽性樣品的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果顯示20個毒株中19株序列彼此不完全相同。它們之間的同源性為79.5%-98.8%。進化分析顯示,這19株序列均為GII,并聚集為3個遺傳簇(clusters)。其中兩個遺傳簇為GII-4,另外一個為GII-3。為分析這些毒株的分子特征,從3個遺傳簇中分別選取一個代表性毒株進行全基因組克隆和基因重組分析。結(jié)果證明,HU/GII/SHANGHAI/SH312/2008/CHN毒株為重組毒株。 二豬SaV小型豬感染模型的建立 本研究采用分離的豬SaV中國株Ch-sw-sav1為攻毒株,通過口服感染SPF級巴馬小型豬,通過收集感染后臨床癥狀、病理變化的相關(guān)信息以及各組織器官中病原的RT-PCR檢測,掌握豬SaV感染豬的第一手資料,為疾病感染機制的研究奠定了基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,攻毒后第二天實驗組豬即出現(xiàn)不同程度腹瀉,個別豬出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象。剖檢結(jié)果顯示,實驗組豬出現(xiàn)腹脹、小腸出血現(xiàn)象。病理切片的光鏡檢測結(jié)果表明:小腸絨毛萎縮、脫落;透射電鏡顯微觀測表明:小腸上皮細胞細胞核或線粒體病變。間接免疫熒光顯示,在小腸各段能檢測到病毒抗原的存在。血常規(guī)檢測結(jié)果顯示,與對照組和空白組相比,實驗組豬在攻毒后白細胞上升,第14天達到最高值,隨后開始下降;血小板在攻毒第21天急劇上升,然后緩慢下降;與對照組和空白組相比,實驗組豬紅細胞沒有明顯變化。RT-PCR結(jié)果顯示,實驗組豬從攻毒第二天即開始排毒,直至實驗結(jié)束(PID36)。 三豬SaV靶細胞受體初步研究 1連接黏附分子1作為豬SaV受體的可能性研究 杯狀病毒中的NoV和貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)的功能性受體分別為人類血型組織抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)和連接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1,JAM-1)。已有的研究數(shù)據(jù)均顯示識別碳水化合物可能是杯狀病毒的共同特征,盡管在長期的進化過程中不同杯狀病毒已適應了不同的宿主細胞。對此,研究人員分別測試了NoV和SaV與HBGAs間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,NoV的VLPs能夠與HBGAs結(jié)合,而SaV GI和GV的VLPs均不能結(jié)合HBGAs。為檢驗JAM-1作為GIII SaV受體的可能性,我們測試了抗JAM-1多抗對SaV病毒感染易感細胞LLC-PK的阻斷效果。在病毒感染細胞前用不同濃度抗JAM-1多抗預先與細胞孵育,隨后用熒光定量PCR方法檢測不同濃度抗體的孵育能否阻斷或者降低病毒對細胞的結(jié)合和感染。結(jié)果顯示,JAM-1抗體不能阻斷或者降低SaV對易感細胞LLC-PK的感染。這表明,JAM-1作為SaV感染宿主細胞的受體可能性較低。 2 VOPBA和Co-IP法篩選豬SaV候選受體 本研究擬采用VOPBA法和免疫共沉淀法結(jié)合質(zhì)譜探索豬SaV在易感細胞LLC-PK細胞表面受體;采用上述兩種方法共鑒定到若干疑似蛋白。根據(jù)這些蛋白的細胞內(nèi)分布和功能結(jié)合文獻分析,選取MHC-1(major histocompatibility complex class I)進行進一步驗證。CO-IP結(jié)果顯示,MHC-I能夠與病毒結(jié)合。 四人NoV病毒樣顆粒(Virus-like particles)表達 本研究采用桿狀病毒表達載體進行GII-4和GII-12毒株的VLPs表達,并用Western-blot和免疫電鏡方法進行抗原性和形態(tài)學鑒定;嘗試將外殼蛋白VP1和綠色熒光蛋白(EGFP)融合表達,以期得到帶有EGFP標記的病毒樣顆粒。研究結(jié)果顯示,所有的重組桿狀病毒均能在Sf9細胞中表達。除了與EGFP融合的蛋白不能成功純化外,其它均能得到合適濃度的重組蛋白。Western-blot和免疫電鏡顯示,這些蛋白均具有抗原性并能自我組織形成病毒樣顆粒,而GII-12的VLPs能夠被抗GII-4 VLPs的抗體所識別。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R181.3

【引證文獻】

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1 莊金秋;梅建國;沈志強;;水貂杯狀病毒生物學特性研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年03期

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本文編號：1354976