本文關(guān)鍵詞：視蛋白基因參與蚊抗藥性機(jī)制的研究

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【摘要】：殺蟲劑的連續(xù)、大量使用導(dǎo)致了蟲媒抗藥性的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而加劇了蟲媒病傳播的惡化趨勢(shì)。鑒定新的抗藥性基因、闡明抗藥性機(jī)制是有效治理蟲媒抗藥性的前提和必要條件。 本研究根據(jù)已知的埃及伊蚊（Aedes aegypti）和淡色庫(kù)蚊（Culex pipienspallens）Opsin基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從白紋伊蚊(Ae. albopictus)C6/36細(xì)胞中擴(kuò)增出白紋伊蚊Opsin基因的開放閱讀框（ORF）序列，T/A克隆入pCR2.1載體并測(cè)序。獲得白紋伊蚊Opsin基因ORF序列為1122bp，編碼373個(gè)氨基酸（NCBI/GenBank JQ354934，2012）。 用BlastX軟件將該基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)Swissprot分析，用ClustalW軟件作序列比對(duì)和聚類分析。推導(dǎo)的氨基酸序列與埃及伊蚊、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、淡色庫(kù)蚊的視蛋白分別具有95%、91%和87%以上的同源性。 將白紋伊蚊Opsin轉(zhuǎn)染白紋伊蚊C6/36細(xì)胞，使其在蚊細(xì)胞中高表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，，在溴氰菊酯濃度為101.5μg/mL，102.0μg/mL和102.5μg/mL時(shí)，opsin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的存活率分別比對(duì)照組增高了22%，14%，21%（p0.05）。采用siRNA技術(shù)干涉白紋伊蚊C6/36細(xì)胞的Opsin基因，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，干涉Opsin基因的效率為81%，在溴氰菊酯濃度為101.5μg/mL，102.0μg/mL和102.5μg/mL時(shí)，干涉組細(xì)胞的存活率分別比對(duì)照組下降15%、16%和21%（p 0.05）。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，白紋伊蚊Opsin與蚊溴氰菊酯抗性有關(guān)，是一個(gè)新的殺蟲劑抗性基因。 為進(jìn)一步研究Opsin參與蚊溴氰菊酯抗性形成的機(jī)制，本研究在蚊細(xì)胞中將Opsin分別高表達(dá)和低表達(dá)后，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)與Opsin相關(guān)的GPCR通路中Arrestin、Gqα基因及代謝抗性基因CYP6A1的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了PLC酶活性的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Opsin基因高表達(dá)后，Arrestin基因表達(dá)無(wú)差異，Gqα基因、CYP6A1基因分別高表達(dá)12倍和99倍，PLC酶活性增高了2.56倍（p0.05）；Opsin基因低表達(dá)后，Arrestin基因表達(dá)無(wú)差異，Gqα基因、CYP6A1基因表達(dá)分別降低了82%和81%，PLC酶活性降低了63%（p0.05）。以上結(jié)果提示，Opsin基因可能通過(guò)影響Gqα基因表達(dá)及PLC酶活性，調(diào)節(jié)代謝酶基因CYP6A1的表達(dá)，從而促進(jìn)代謝酶對(duì)殺蟲劑的降解而對(duì)蚊細(xì)胞有保護(hù)作用。進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，分析Opsin、Arrestin、Gqα、PLC基因在蚊活體抗性品系和敏感品系中的表達(dá)差異。結(jié)果蚊活體與蚊細(xì)胞一致，Opsin、Arrestin、Gqα、PLC基因在淡色庫(kù)蚊抗性蚊中的表達(dá)分別是敏感蚊的10.42、5.64、3.34、2.16倍（p0.05）。Western blotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Opsin蛋白在無(wú)錫、塘口抗性蚊中較相應(yīng)敏感蚊高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室鄒萍等在研究Arrestin基因與蚊溴氰菊酯抗性的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Arrestin基因在蚊細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)后，溴氰菊酯處理后的細(xì)胞存活率、Opsin基因與CYP6A1基因表達(dá)均增高；Arrestin基因低表達(dá)后，細(xì)胞存活率、Opsin基因與CYP6A1基因表達(dá)均降低。綜合以上結(jié)果提示，GPCR信號(hào)通路可能作為一種新的機(jī)制參與了蚊抗藥性的形成，即Arrestin可調(diào)控Opsin的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控Gqα及PLC酶活性，影響CYP6A1基因的表達(dá)而導(dǎo)致蚊對(duì)溴氰菊酯抗性。 以淡色庫(kù)蚊活體為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究不同地區(qū)溴氰菊酯抗性和敏感蚊、對(duì)溴氰菊酯不同抗性水平的蚊、對(duì)不同殺蟲劑抗性蚊中Opsin基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，無(wú)錫抗性蚊中Opsin基因表達(dá)是敏感蚊的5.81倍（p0.05），用接觸筒法區(qū)分的南京抗性蚊中Opsin基因表達(dá)是敏感蚊的4.53倍（p0.05）。經(jīng)溴氰菊酯逐代篩選的塘口抗性蚊（LC50分別為0.05、0.1、0.5、0.55ppm）中Opsin基因表達(dá)分別是敏感蚊（LC500.02ppm）的1.30、2.50、3.99、10.42倍（p0.05）。濟(jì)寧對(duì)氯氰菊酯抗性蚊、對(duì)DDVP抗性蚊、對(duì)殘殺威抗性蚊中Opsin基因的表達(dá)分別是敏感蚊的4.46、10.00、23.05倍（p0.05）。分別提取塘口、無(wú)錫對(duì)溴氰菊酯抗性蚊和敏感蚊的全蛋白，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)Opsin、Arrestin蛋白表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Opsin蛋白在塘口、無(wú)錫抗性蚊中較相應(yīng)敏感蚊高表達(dá)1.94及1.68倍， Arrestin蛋白在塘口、無(wú)錫抗性蚊中的表達(dá)量分別是相應(yīng)敏感蚊的1.20及1.10倍。以上結(jié)果提示，Opsin基因在殺蟲劑抗性蚊中高表達(dá)是一種普遍現(xiàn)象，其有望作為蚊抗藥性檢測(cè)的潛在靶標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R184

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1275852