本文關(guān)鍵詞：2009年深圳地區(qū)杯狀病毒感染的分子流行病學(xué)特征

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【摘要】：研究背景和目的： 諾如病毒(Norovirus, NoV)最早是從1968年在美國(guó)諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉的患者糞便中分離的病原,并以發(fā)現(xiàn)地將其命名為諾瓦克病毒(Norwalk virus, NLVs)。由于該病毒無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),不能建立動(dòng)物模型,亦沒(méi)有敏感的診斷技術(shù),所以在較長(zhǎng)時(shí)間里(約20年),只能用電鏡進(jìn)行小規(guī)模的糞便標(biāo)本檢測(cè)。最初,這類病毒以電鏡下的形態(tài)和發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)命名和分類,隨著病毒種類的增多,該種命名和分類的方式很容易引起混亂的缺點(diǎn)日趨明顯。目前病毒的分類和命名主要根據(jù)病毒形態(tài)學(xué)、抗原特性、宿主范圍和所致疾病的臨床癥狀,特別是病毒基因組序列和結(jié)構(gòu)以及遺傳學(xué)進(jìn)化分析的結(jié)果進(jìn)行。經(jīng)杯狀病毒組研究組(calicivirus study group, CSG)1998年建議,國(guó)際病毒分類委員會(huì)(the international committee on taxonomy of viruses, ICTV)批準(zhǔn),將杯狀病毒分為四個(gè)屬,分別是：①Lagovirus:以兔出血病病毒(rabbit hemorrhagic disease virus)為代表：②NoV;③SaV(Sapovirus, SaV);④Vesivirus:以豬水泡疹病毒(swine vesicular exanthema virus)為代表。其中Lagovirus和Vesivirus感染動(dòng)物；而NoV和SaV主要感染人,二者又合稱為人類杯狀病毒(Human Calicivirus, HuCV)。 20世紀(jì)90年代初,NoV病毒的成功克隆和測(cè)序分析,大大推動(dòng)了杯狀病毒的研究,并且分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,進(jìn)一步為NoV的深入研究提供了便利條件,對(duì)NoV引起急性胃腸炎(acut gastroenteritis, AGE)的危害和意義逐漸得到了充分認(rèn)識(shí)。NoV作為引起人類AGE爆發(fā)和散發(fā)的重要病原體之一,具有典型季節(jié)相關(guān)性,在世界各地都有廣泛傳播,能夠感染所有的年齡組人群,極易引起爆發(fā),成為難以控制的胃腸炎疾病,極大影響著人群公共健康。NoV的共同特征是：直徑約為26-35nm,無(wú)包膜,表面粗糙,球形,呈20面體對(duì)稱；可從AGE病人的糞便中分離得到,但不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng),也沒(méi)有合適的動(dòng)物模型；基因組為無(wú)包裹的單股正鏈RNA病毒,RNA鏈全長(zhǎng)約7.7kb,包括3個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORFs):ORF1基因全長(zhǎng)5100bp,位于基因組中5-5104nt之間,編碼一種具有保守序列的多聚酶非結(jié)構(gòu)蛋白,此結(jié)構(gòu)蛋白可裂解為p48、NTPase、p22、vpg、3c-like protein和polymerase6個(gè)小蛋白；ORF2基因全長(zhǎng)1632bp,位于基因組中5085～6707nt之間,編碼一種分子量約為56KD的衣殼蛋白VP1; ORF3基因全長(zhǎng)807bp,位于基因組中6707-7513nt之間,編碼一種約為22.5KD的微小結(jié)構(gòu)蛋白VP2。 NoV具有高度的基因多樣性,被分為5個(gè)遺傳組,其中GⅠ、GⅡ、GⅣ僅感染人類,而GⅢ、GⅤ分別感染牛和鼠。GⅠ和GⅡ又至少可以進(jìn)一步劃分為8和17個(gè)基因型,GⅢ分為兩個(gè)基因型,另外檢測(cè)出新的基因型被定義為GⅡ.b型。NoV之所以具有高度的遺傳多樣性,主要是因?yàn)镽NA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA Polymerase, RdRp)缺乏校正功能而引起核苷酸位點(diǎn)突變以及不同病毒株間基因重組。 SaV屬于HuCV的另一種屬,首次發(fā)現(xiàn)于1976年,也是引起人類AGE爆發(fā)和散發(fā)的重要病原體,在世界各地都有廣泛傳播,能夠感染所有的年齡組人群。由于SaV引起的感染不如NoV嚴(yán)重,因此對(duì)SaV的重視程度和研究深度也均不如NoV。SaV是一種未被包裹的單股正鏈RNA病毒,其基因組RNA鏈全長(zhǎng)約7.3-7.5kb,包括3個(gè)開放閱讀框(ORFs)。ORF1編碼結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白,capsid protein)和非結(jié)構(gòu)蛋白(RdRp); ORF2編碼一種基本小蛋白；ORF3與ORF1交迭,只存在于GⅠ、GⅣ、GⅤ型中,編碼一種未知功能的蛋白。SaV根據(jù)RNA聚合酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)的基因多樣性,可以進(jìn)一步分為5個(gè)遺傳組,其中GⅠ型、GⅡ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人,GⅢ主要感染豬。 病毒性胃腸炎是世界各國(guó)高發(fā)疾病之一,尤其在發(fā)展中國(guó)家,因胃腸炎疾病死亡的兒童人數(shù)高于發(fā)達(dá)國(guó)家。隨著研究的深入,HuCV尤其是NoV的感染在急性非細(xì)菌性腹瀉中的地位越來(lái)越重要,僅次于RV感染。我國(guó)NoV感染十分普遍,優(yōu)勢(shì)毒株分布雖各地有所差異,但主要以GⅡ.4型為主,對(duì)不同地區(qū)NoV感染型別是否有變異、優(yōu)勢(shì)株是否發(fā)生變化的鑒定及分析可以豐富我國(guó)NoV的研究資料,對(duì)于進(jìn)一步了解NoV進(jìn)化具有重要意義。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)SaV的研究不是很深入,但是近年來(lái)的研究數(shù)據(jù)表明由SaV引起的疾病暴發(fā)有增加趨勢(shì)。為此,我們對(duì)2009年深圳地區(qū)腹瀉患者HuCV的流行情況及型別進(jìn)行了研究,以了解當(dāng)?shù)豊oV和SaV基因型別分布特征,探討流行的優(yōu)勢(shì)毒株；分析深圳地區(qū)HuCV的流行特征,豐富南方腹瀉病毒感染的相關(guān)資料,為我國(guó)腹瀉感染提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)和流行病學(xué)背景資料。 方法： 1.以深圳龍崗中心醫(yī)院、北大深圳醫(yī)院、龍華人民醫(yī)院和西鄉(xiāng)人民醫(yī)院等醫(yī)院為監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院,按監(jiān)測(cè)方案要求采集病毒性腹瀉病例糞便標(biāo)本。收集2009年病毒性腹瀉患兒糞便標(biāo)本,每份標(biāo)本取樣5～10g或5～10ml。病毒性腹瀉病例定義為大便次數(shù)≥3次/d,呈水樣、蛋花樣或稀糊樣便,常規(guī)鏡檢WBC15, RBC=0,排除常見細(xì)菌、寄生蟲等感染的腹瀉病例。 2.對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行核酸提取,用三對(duì)分型引物GISKF/GISKR、COG2F/GII SKR和SLV5317/SLV5749一步法三重RT-PCR擴(kuò)增NoV和SaV的衣殼區(qū)(Capsid), PCR產(chǎn)物純化回收、測(cè)序,應(yīng)用BLAST將測(cè)序結(jié)果在GenBank上尋找與各株同源序列,應(yīng)用Clustal W進(jìn)行多序列對(duì)比分析和MEGA4.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹,進(jìn)行NoV和SaV基因型別分析,判斷NoV和SaV流行優(yōu)勢(shì)株。 3.運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0對(duì)收集的患者資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(卡方檢驗(yàn)),分析深圳地區(qū)杯狀病毒感染的流行概況。 結(jié)果： 1.深圳地區(qū)HuCV感染全年均可發(fā)病,NoV感染主要發(fā)生在5一10月份,SaV感染主要發(fā)生在春秋冬季節(jié)；NoV和SaV感染在不同月份之間存在差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NoV和SaV感染檢出率在不同性別和年齡段之間沒(méi)有顯著性差異。 2.本研究對(duì)收集的852份腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行檢測(cè),共檢出67株NoV GⅡ型,檢出率為7.86%；3株NoV GⅠ型,檢出率為0.35%；對(duì)隨機(jī)抽取的32株NoV GⅡ型和3株GⅠ型樣本,分別進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析：其中22株屬于NoV GⅡ.4型,6株屬于NoV GⅡ.3型,2株屬于NoV GⅡ.12型,GⅡ.2型和GⅡ.14型各有一例；3株NoV GⅠ型分屬于三個(gè)型別：GⅠ.1、GⅠ.3和GI.4型。 3.16株測(cè)序SaV樣本中8株屬于G1型(3株為GⅠ.1,5株為GⅠ.2),7株屬于GⅣ型,1株屬于GⅡ.1型。 4.JB030920397和JB030920633兩株不能歸為現(xiàn)存的NoV GⅡ.3亞型a-c,為新發(fā)現(xiàn)的GⅡ.3亞型；SaV GⅣ型為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道的SaV基因型別。 結(jié)論： 深圳地區(qū)HuCV感染全年均可發(fā)病,NoV感染主要發(fā)生在夏季,SaV感染主要發(fā)生在春秋季節(jié)；NoV和SaV感染除了在不同月份之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在不同性別和年齡段之間沒(méi)有顯著性差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)意義；深圳地區(qū)存在NoV GⅠ和GⅡ型感染,HuCV流行優(yōu)勢(shì)毒株為NoV GⅡ.4型,本研究發(fā)現(xiàn)了兩株新的NOV GⅡ.3亞型,表明NoV在深圳地區(qū)感梁具有高度遺傳多樣性,是重要的致瀉病原體；SaV流行優(yōu)勢(shì)毒株為SaV GⅠ型；發(fā)現(xiàn)的SaV GⅣ型為我國(guó)首次報(bào)道,表明深圳地區(qū)存在SaV感染,具有基因多樣性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R181.3

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