本文關(guān)鍵詞：家蠅M.domestica L.對(duì)敵敵畏抗藥性選育及快速檢測(cè)方法研究

  更多相關(guān)文章： 家蠅 有機(jī)磷 抗藥性 乙酰膽堿酯酶 Ace基因

【摘要】：背景家蠅Musca domestica Linnaeus (Housefly)是世界性分布的衛(wèi)生害蟲之一,可傳播多種疾病,對(duì)人類危害極大。長(zhǎng)期以來人們主要使用化學(xué)方法對(duì)家蠅進(jìn)行防治,導(dǎo)致其對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性,這嚴(yán)重影響了殺蟲劑的可持續(xù)防治效果,妨礙了衛(wèi)生防疫工作的有效進(jìn)行。因此,在了解抗藥種類及抗性程度的基礎(chǔ)上,加強(qiáng)科學(xué)治理是目前家蠅防控工作的重點(diǎn)之一。在對(duì)家蠅抗藥性進(jìn)行研究時(shí),為避免野生型家蠅存在復(fù)雜的交互抗性和齡期不齊的問題,研究人員通常會(huì)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)定向選育抗性家蠅以提供合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,但目前對(duì)如何進(jìn)行高效的抗藥性選育尚無定論�？顾幮援a(chǎn)生的原因比較復(fù)雜,既可以是單因子作用也可以是多因子聯(lián)合作用,一般可分為生理、生化和行為三種抗性機(jī)制。乙酰膽堿酯酶(AChE)作為有機(jī)磷殺蟲劑(OPs)和氨基甲酸酯類殺蟲劑(CBs)的共同作用靶標(biāo),在家蠅對(duì)這兩種殺蟲劑的抗藥性中扮演著重要角色。目前已研究證實(shí)家蠅的AChE由其體內(nèi)Ace基因編碼,Ace基因點(diǎn)突變可導(dǎo)致AChE結(jié)構(gòu)改變,變構(gòu)的AChE對(duì)殺蟲劑親和力降低,表現(xiàn)為敏感性下降,從而使家蠅產(chǎn)生抗藥性。已有學(xué)者總結(jié)出家蠅的15個(gè)Ace等位基因,其中有11個(gè)等位基因可編碼出對(duì)殺蟲劑敏感的AChE,其余4個(gè)等位基因編碼的AChE對(duì)殺蟲劑有不同程度的不敏感性。隨著對(duì)抗性機(jī)制研究的深入,抗藥性的生物、化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法發(fā)展很快,與傳統(tǒng)的生物學(xué)方法相比,新方法在準(zhǔn)確性、重復(fù)性及抗性早期檢測(cè)等方面有明顯的優(yōu)勢(shì),但由于技術(shù)、成本以及無法對(duì)昆蟲整體做評(píng)估等原因,新方法目前主要用于遺傳學(xué)方面的研究,尚未作為基層抗性檢測(cè)常規(guī)手段使用。本研究的目的就是在對(duì)抗性家蠅選育方法進(jìn)行規(guī)范的基礎(chǔ)上研究抗性家蠅AChE的生化特征,據(jù)此建立一種快速易行的家蠅對(duì)敵敵畏(DDVP)抗藥性初步檢測(cè)方法,同時(shí)分析選育出的抗性家蠅Ace基因突變結(jié)果。 方法本研究采用DDVP對(duì)實(shí)驗(yàn)室敏感品系家蠅進(jìn)行抗性選育,用點(diǎn)滴法測(cè)得選育后各代家蠅半數(shù)致死量(LD50),計(jì)算抗性系數(shù),對(duì)藥膜法、點(diǎn)滴法和幼蟲汰選法三種選育方法進(jìn)行比較;同時(shí)以幼蟲數(shù)量、幼蟲均重、蛹數(shù)量、蛹均重、成蟲數(shù)、成蟲均重、化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo),探討DDVP對(duì)家蠅幼蟲的毒性作用。提取選育所得不同抗性的家蠅頭部粗酶源,對(duì)其定量后進(jìn)行酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn),以碘代硫化乙酰膽堿(ATCh)為底物,5,5-雙二硫代(2-硝基苯甲酸()DNTB)為顯色劑,通過測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下反應(yīng)體系吸光度(A)值,計(jì)算AChE的活性和抑制活性,比較不同世代家蠅AChE對(duì)DDVP敏感性的差異,在此基礎(chǔ)上確定可完全抑制敏感家蠅AChE活性的DDVP濃度,據(jù)此建立通過直接觀察顯色反應(yīng)定性檢測(cè)家蠅抗藥性的方法。提取敏感及抗性家蠅體內(nèi)RNA,通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)得到家蠅Ace基因片段,用DNAstar軟件分析比對(duì)敏感與抗性家蠅Ace基因序列,再利用BLAST Sequence Similarity Searching工具,將測(cè)得序列與GenBank中注冊(cè)過的家蠅Ace抗藥性等位基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,在分子水平上對(duì)選育家蠅的抗藥性進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果對(duì)抗性系數(shù)為1.29的家蠅使用藥膜法、點(diǎn)滴法和幼蟲汰選法分別進(jìn)行5次抗藥性選育后,抗性系數(shù)各達(dá)到2.12、8.91和19.35倍,各代家蠅的體重?zé)o顯著差異。DDVP對(duì)家蠅幼蟲的毒性主要表現(xiàn)為致死和致畸作用,幼蟲存活率、化蛹率、羽化率均以及蛹均重和成蟲均重與DDVP濃度呈負(fù)相關(guān),畸變的數(shù)量和程度與DDVP濃度成正比,但給藥濃度對(duì)家蠅幼蟲化蛹時(shí)間及羽化時(shí)間的影響不大,家蠅的性別比也與DDVP濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各抗性家蠅與敏感家蠅的粗酶蛋白含量及AChE活性的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各世代家蠅AChE的抑制活性與DDVP濃度呈負(fù)相關(guān),但在一定范圍內(nèi)(DDVP濃度0.6mg/mL時(shí)),抗性家蠅AChE均表現(xiàn)出一定的不敏感性,抗性系數(shù)越高,不敏感性越強(qiáng)。據(jù)計(jì)算,隨著抗藥性的加大,DDVP對(duì)AChE的抑制中濃度顯著增大。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析后,把0.08mg/mL作為DDVP對(duì)敏感家蠅和抗性家蠅活性抑制的臨界濃度,可用來進(jìn)行抗藥性的快速檢測(cè)。Ace基因測(cè)序結(jié)果表明培育出的抗性家蠅與敏感家蠅相比存在7個(gè)點(diǎn)突變、1處插入和1處缺失現(xiàn)象。 結(jié)論1.與藥膜法和點(diǎn)滴法相比,用幼蟲汰選法培育家蠅抗藥性的抗性產(chǎn)生速度更快;2.幼蟲期施藥不會(huì)延緩家蠅發(fā)育時(shí)間,但對(duì)家蠅的數(shù)量和重量有影響;3.家蠅對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性與其體內(nèi)AChE含量增加或活性增高無關(guān),是AChE對(duì)殺蟲劑敏感性下降造成的;4.通過本課題的研究,初步建立家蠅對(duì)DDVP抗藥性快速定性檢測(cè)方法;5.本實(shí)驗(yàn)選育得到的抗性家蠅Ace基因序列與GeneBank中注冊(cè)的Ace抗藥性等位基因v15(注冊(cè)序列號(hào)FJ174267.1)序列完全一致。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R184

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡興強(qiáng),劉強(qiáng),崔海粟,龔清峰,吳明生;家蠅對(duì)四種殺蟲劑抗藥性調(diào)查研究[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2002年03期

2 王瑞恒;劉利民;趙金玲;孫學(xué)科;孫琳琳;周剛;;基于等位基因特異性PCR原理建立的SNP分型新方法[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

3 胡小邦,朱昌亮;昆蟲抗藥性機(jī)制研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2004年01期

4 亢春雨;趙春青;吳剛;;昆蟲抗藥性分子機(jī)制研究的新進(jìn)展[J];華東昆蟲學(xué)報(bào);2007年02期

5 曹曉梅,宋鋒林,趙彤言,董言德,孫晨熹;Kdr等位基因頻率與家蠅對(duì)溴氰菊酯抗性的關(guān)系[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2004年04期

6 李梅,何鳳琴,邱星輝;家蠅抗藥性的分子遺傳機(jī)制[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2005年04期

7 李春曉;趙彤言;;蚊蟲對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯抗性相關(guān)羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶基因研究進(jìn)展[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2006年01期

8 汪中明;高希武;;家蠅敵敵畏抗性品系的選育以及乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的變化[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2008年03期

9 徐慶;王沖;龔孝忠;徐承龍;鄭一平;;南京地區(qū)家蠅抗藥性的調(diào)查與對(duì)策[J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué);2008年02期

10 王利華,吳益東;與擬除蟲菊酯抗性相關(guān)的煙粉虱鈉通道基因突變及其檢測(cè)[J];昆蟲學(xué)報(bào);2004年04期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 任曉霞;棉鈴蟲Helicoverpa armigera （Hübner）對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑靶標(biāo)抗性機(jī)制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

2 李飛;棉蚜的殺蟲劑神經(jīng)靶標(biāo)分子生物學(xué)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

3 尚金燕;家蠶兩種類型乙酰膽堿酯酶基因的分析[D];浙江大學(xué);2006年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 曹娟;抗性和敏感性棉蚜的乙酰膽堿酯酶和酯酶的比較研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

2 徐欣;殺蟲劑對(duì)不同蟲態(tài)家蠅抗藥性的影響及其作用機(jī)理的研究[D];山東師范大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：1201396