發(fā)布時(shí)間：2017-10-19 13:27

  本文關(guān)鍵詞：孢子絲菌病的流行病學(xué)分析及T-DNA插入突變體的研究

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【摘要】：孢子絲菌病是一種由申克孢子絲菌引起的皮膚真菌病，偶可播散至內(nèi)臟引起全身播散型感染。對(duì)孢子絲菌病進(jìn)行有效的防治，首先要明確其流行病學(xué)和病原學(xué)特點(diǎn)。我國(guó)孢子絲菌病多發(fā)生于東北地區(qū)，吉林省是孢子絲菌病的高發(fā)區(qū)。近年來(lái)，申克孢子絲菌引起的皮膚真菌病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，了解吉林省孢子絲菌病的流行病學(xué)特點(diǎn)對(duì)今后孢子絲菌病的預(yù)防和治療具有重要意義。 從分子水平研究申克孢子絲菌的基因功能，有助于揭示其病原學(xué)特征和致病機(jī)制。利用分子標(biāo)簽獲得突變體是進(jìn)行基因功能研究的有效手段。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)（ATMT）具有轉(zhuǎn)化受體類別多、轉(zhuǎn)化效率高、突變體遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于絲狀真菌基因功能的研究。 本研究將ATMT技術(shù)用于申克孢子絲菌的研究，優(yōu)化了孢子懸液濃度、農(nóng)桿菌的誘導(dǎo)時(shí)間以及共培養(yǎng)介質(zhì)等影響轉(zhuǎn)化效率的因素，提高了T-DNA的轉(zhuǎn)化效率，建立了申克孢子絲菌T-DNA插入突變體庫(kù)。通過(guò)篩選獲得了一些表型明顯變化的突變體，利用TAIL-PCR方法獲得T-DNA插入側(cè)翼序列，定位插入位點(diǎn)，進(jìn)而分析突變體的基因功能。其中，突變體841是一株銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因被打斷的突變體，本研究推測(cè)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與調(diào)控申克孢子絲菌的生長(zhǎng)和抗氧化應(yīng)激的能力，并與申克孢子絲菌的致病力有關(guān)。 1.孢子絲菌病的流行病學(xué)分析 了解孢子絲菌病的流行病學(xué)特點(diǎn)，對(duì)于控制和預(yù)防孢子絲菌病的發(fā)生具有重要意義。本研究對(duì)208例孢子絲菌病患者進(jìn)行了流行病學(xué)分析。結(jié)果表明，女性發(fā)病率較高，男女發(fā)病比率為1:1.51。發(fā)病年齡最小為3歲，最大為87歲，平均年齡為47歲，各年齡段均可感染該病。青壯年發(fā)病率最高（67.3％），其次是老年人（27.9％），未成年人發(fā)病率最低（12.5％）。農(nóng)民占大多數(shù)（68.6％），且多有外傷史。固定型孢子絲菌病常見(jiàn)，其次是淋巴管型，播散型少見(jiàn)，僅有1例。發(fā)病部位以面部和上肢為主，固定型多發(fā)生在面部和上肢，淋巴管型多發(fā)生在上肢，播散型表現(xiàn)為全身感染。冬季發(fā)病率最高（37.5％），冬季為孢子絲菌病的高發(fā)季節(jié)。 2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及突變體的分析 本研究?jī)?yōu)化了影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素，建立了穩(wěn)定、高效的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化體系:（1）誘導(dǎo)條件：根癌農(nóng)桿菌的初始OD600nm為0.3，乙酰丁香酮濃度為200μM,誘導(dǎo)時(shí)間為6h；（2）共培養(yǎng)介質(zhì)和條件：申克孢子絲菌孢子濃度為106個(gè)/ml,乙酰丁香酮濃度為200μM，孢子懸液和誘導(dǎo)6h的農(nóng)桿菌以1：1混合，，均勻涂布于含微孔濾膜的共培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48h；（3）篩選培養(yǎng)條件：25℃培養(yǎng)4天。在上述轉(zhuǎn)化條件下，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1000-1200個(gè)突變體/106個(gè)孢子。本研究獲得了4500株突變體，初步建立了申克孢子絲菌的突變體庫(kù)。T-DNA插入突變體的遺傳穩(wěn)定性高，可通過(guò)有絲分裂穩(wěn)定遺傳。從突變體庫(kù)中篩選出7株表型變化明顯的突變體，并成功擴(kuò)增其T-DNA插入側(cè)翼序列，利用生物信息學(xué)分析被打斷基因的功能。 3.申克孢子絲菌銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能研究 微量元素銅是微生物維持自身生長(zhǎng)和發(fā)育不可缺少的重要條件。在多數(shù)蛋白質(zhì)發(fā)揮功能時(shí)，銅擔(dān)當(dāng)著重要角色。本研究篩選出一株表型變化明顯的突變體，通過(guò)TAIL-PCR方法獲得了T-DNA插入側(cè)翼序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析，與稻瘟病菌、馬爾尼菲青霉、黑曲霉、巴西副球孢子菌等真菌的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因同源性較高，命名為CTP基因。利用genebank數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，本研究成功克隆出該基因片段，長(zhǎng)度為1300bp。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)突變體841的形態(tài)發(fā)生較大變化，菌絲較細(xì)，排列雜亂，分生孢子數(shù)量減少，易脫落。與野生型相比，突變體841生長(zhǎng)速度無(wú)變化，但其酵母相的轉(zhuǎn)化能力變?nèi)�，且�?duì)過(guò)氧化氫敏感，抗氧化應(yīng)激能力下降。在小鼠系統(tǒng)性感染模型中，突變體841表現(xiàn)出較低的致病力。這些結(jié)果表明銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因調(diào)控了申克孢子絲菌的生長(zhǎng)和抗氧化應(yīng)激的能力，并且與致病力相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：孢子絲菌病 申克孢子絲菌 流行病學(xué) T-DNA 突變體
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R756;R181.3
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮寫詞表9-13
• 第1章 緒論13-22
• 1.1 申克孢子絲菌和孢子絲菌病13-16
• 1.1.1 申克孢子絲菌的分類學(xué)研究13
• 1.1.2 申克孢子絲菌的形態(tài)學(xué)研究13-14
• 1.1.3 孢子絲菌病的發(fā)病機(jī)制14-15
• 1.1.4 孢子絲菌病的流行病學(xué)研究15-16
• 1.2 真菌 T-DNA 插入突變的研究進(jìn)展16-20
• 1.2.1 突變體庫(kù)的構(gòu)建方法研究進(jìn)展16-17
• 1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)17-18
• 1.2.3 T-DNA 插入側(cè)翼序列的分離方法18-20
• 1.3 銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的研究進(jìn)展20-22
• 第2章 孢子絲菌病的流行病學(xué)分析22-28
• 2.1 材料22
• 2.1.1 標(biāo)本收集22
• 2.2 方法22
• 2.2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法22
• 2.3 結(jié)果22-26
• 2.3.1 性別與年齡22-23
• 2.3.2 職業(yè)與外傷史23
• 2.3.3 臨床表現(xiàn)及發(fā)病部位23-25
• 2.3.4 發(fā)病季節(jié)25
• 2.3.5 分布區(qū)域25-26
• 2.4 討論26-28
• 第3章 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及突變體的分析28-45
• 3.1 材料28-30
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒28
• 3.1.2 培養(yǎng)基及配置方法28-29
• 3.1.3 試劑與引物29-30
• 3.2 儀器設(shè)備30
• 3.3 方法30-33
• 3.3.1 突變體篩選所需潮霉素 B 的濃度30
• 3.3.2 抑制根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)所需頭孢菌素的濃度30-31
• 3.3.3 根癌農(nóng)桿菌 AGL-1 的活化和誘導(dǎo)培養(yǎng)31
• 3.3.4 申克孢子絲菌 JLCC32757 分生孢子的培養(yǎng)31
• 3.3.5 根癌農(nóng)桿菌 AGL-1 轉(zhuǎn)化申克孢子絲菌的步驟31
• 3.3.6 突變體的遺傳穩(wěn)定性分析31-32
• 3.3.7 申克孢子絲菌及突變體菌絲體的培養(yǎng)和收集32
• 3.3.8 申克孢子絲菌基因組 DNA 的提取32
• 3.3.9 菌落表型變化突變體的篩選及 T-DNA 側(cè)翼序列分析32-33
• 3.4 結(jié)果33-42
• 3.4.1 潮霉素 B 對(duì)申克孢子絲菌孢子萌發(fā)的抑制作用33-34
• 3.4.2 頭孢菌素對(duì)根癌農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抑制作用34-35
• 3.4.3 突變體的遺傳穩(wěn)定性分析35
• 3.4.4 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化35-40
• 3.4.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的申克孢子絲菌轉(zhuǎn)化體系的確定和突變體庫(kù)的構(gòu)建40-41
• 3.4.6 表現(xiàn)變化突變體的篩選及其 T-DNA 側(cè)翼序列的擴(kuò)增41-42
• 3.4.7 表型變化突變體 T-DNA 插入側(cè)翼序列的生物信息學(xué)分析42
• 3.5 討論42-45
• 第4章 申克孢子絲菌銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能研究45-59
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45
• 4.1.2 試劑及引物45-46
• 4.2 儀器設(shè)備46-47
• 4.3 方法47-49
• 4.3.1 申克孢子絲菌菌絲體的培養(yǎng)和收集47
• 4.3.2 申克孢子絲菌基因組 DNA 的提取47
• 4.3.3 申克孢子絲菌基因組 RNA 的提取47
• 4.3.4 突變體 841 潮霉素基因的擴(kuò)增47
• 4.3.5 突變體 841T-DNA 側(cè)翼序列的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析47
• 4.3.6 申克孢子絲菌及突變株 841 的形態(tài)觀察47-48
• 4.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量分析 CTP 基因的表達(dá)量48
• 4.3.8 申克孢子絲菌尾靜脈感染小鼠實(shí)驗(yàn)48-49
• 4.4 結(jié)果49-57
• 4.4.1 突變體 841 的潮霉素抗性基因擴(kuò)增結(jié)果49
• 4.4.2 突變體 841T-DNA 插入側(cè)翼序列擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析49-51
• 4.4.3 突變體 841 的形態(tài)觀察51-53
• 4.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量分析 CTP 基因的表達(dá)量53-54
• 4.4.5 突變體 841 的致病力分析54-57
• 4.5 討論57-59
• 第5章 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果68-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉秀穎;何秀萍;盧瑩;張博潤(rùn);;基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇工業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵性能[J];生物工程學(xué)報(bào);2011年07期

本文編號(hào)：1061357