本文關(guān)鍵詞：Cdc42對(duì)小鼠釉質(zhì)發(fā)育影響的初步研究

  更多相關(guān)文章： 小鼠 成釉細(xì)胞 cdc42 釉基質(zhì)蛋白

【摘要】：研究背景和目的在牙齒牙釉質(zhì)的發(fā)育過(guò)程中,成釉細(xì)胞的功能十分重要。它既具有合成和分泌釉質(zhì)基質(zhì)的功能,又對(duì)其合成分泌的基質(zhì)有重吸收以及降解的作用,同時(shí)它還和鈣鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān),因此成釉細(xì)胞是釉質(zhì)形成過(guò)程中十分關(guān)鍵的細(xì)胞。當(dāng)外界環(huán)境或者內(nèi)在營(yíng)養(yǎng)、遺傳等因素發(fā)生變化時(shí),都有可能導(dǎo)致成釉細(xì)胞的分化產(chǎn)生異常,從而會(huì)造成牙釉質(zhì)不同程度的發(fā)育不全。為了明確釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程及其影響因素,許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)成釉細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)探索。在導(dǎo)致牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)異常的各種疾病原因中,由于遺傳因素而不涉及全身其他疾病的異常稱為遺傳性牙釉質(zhì)發(fā)育不全(amelogenesis imperfecta,AI)。目前我國(guó)對(duì)觸的研究多局限于家族病例的報(bào)道,而國(guó)外學(xué)者對(duì)AI的病因進(jìn)行了深入探索。對(duì)于導(dǎo)致趟的病因中,首先被確定的致病基因是編碼釉原蛋白的基因。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)的釉原蛋白(AMELX),釉蛋白(ENAM),金屬基質(zhì)蛋白酶20(MMP20)和絲氨酸蛋白酶4(KLK4)這四個(gè)致越基因的突變數(shù)目分別為15、9、4和1。但它們突變引起的舡僅占所研究越家族數(shù)目的四分之一,這說(shuō)明還存在別的與趟發(fā)病相關(guān)基因[2]。很多學(xué)者也對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究。近來(lái)的研究開始圍繞著Rho介導(dǎo)的信號(hào)通路在釉質(zhì)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮的潛在調(diào)節(jié)作用[捫。Rho蛋白屬于小G蛋白家族,是Ras超家族的亞家族成員。通常,我們根據(jù)Rho蛋白基因序列的同源程度和功能不同,可以將其分為RhoA、 Rac1、Cdc42及缺乏GTP酶活性等四大類。其中RhoA、Rac1、Cdc42經(jīng)常被學(xué)者們作為研究的重點(diǎn)。Rho蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起主調(diào)控器的作用,大部分Rho蛋白快速轉(zhuǎn)換于與GTP結(jié)合和與GDP結(jié)合這兩種狀態(tài)之間,即活化狀態(tài)和非活化狀態(tài)。因此,它能夠在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到“分子開關(guān)”作用。它們?cè)谡{(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架方面起到舉足輕重的作用,同時(shí)顯著影響轉(zhuǎn)錄因子活性、膜運(yùn)輸途徑、細(xì)胞極性和微管動(dòng)力學(xué)。即它們參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)吞作用和胞外分泌、細(xì)胞形狀和細(xì)胞與細(xì)胞相互作用,以及調(diào)控細(xì)胞極性、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等生理過(guò)程[5,61。作為Rho蛋白家族的主要成員之一,細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在與GTP結(jié)合時(shí)呈激活狀態(tài),反之與GDP相結(jié)合時(shí)則呈失活狀態(tài)。在與GTP結(jié)合時(shí),Cdc42能夠激活其下游的效應(yīng)因子,進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致一系列的細(xì)胞反應(yīng)。研究顯示Cdc42在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、程序化死亡、細(xì)胞極性的建立等方面起到重要作用,在細(xì)胞內(nèi)參與了許多重要的代謝調(diào)控過(guò)程。Cdc42能夠誘導(dǎo)偽足等的重建,并且使肌動(dòng)蛋白多聚化和組裝[7],從而參與了細(xì)胞骨架的維持及重組。同時(shí),有研究人員認(rèn)為Cdc42是通過(guò)影響p21CIPI的功能從而參與調(diào)控錨定依賴性細(xì)胞的細(xì)胞周期[8],以及在細(xì)胞外因子刺激細(xì)胞引起的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮較重要作用。此外,Cdc42分子有助于細(xì)胞內(nèi)吞作用,常發(fā)生于一些特殊的微環(huán)境。目前,尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)Cdc42蛋白在牙齒發(fā)育過(guò)程尤其釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中具體表達(dá)情況以及發(fā)揮作用的研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在明確Cdc42在小鼠牙齒發(fā)育過(guò)程中的具體表達(dá),并且對(duì)其在小鼠成釉細(xì)胞中可能發(fā)生的作用進(jìn)行初步探討。本論文分以下四個(gè)部分內(nèi)容：第一章：Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育中的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)分別獲取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5的小鼠磨牙牙胚,經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明、包埋蠟塊,最后得到組織切片。將組織切片進(jìn)行HE染色和組織免疫熒光檢測(cè)。通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)整個(gè)牙胚發(fā)育包括蕾狀期、帽狀期、鐘狀期、鐘狀晚期等過(guò)程中Cdc42的表達(dá)情況,初步了解其在牙胚發(fā)育尤其釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中都有不同程度的表達(dá)。第二章：小鼠成釉細(xì)胞離體培養(yǎng)、純化及鑒定本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶消化法體外培養(yǎng)小鼠成釉細(xì)胞,縮短培養(yǎng)時(shí)間。以基底膜抽提物包被,利于細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)。并通過(guò)差速消化法,可獲得純化的成釉細(xì)胞。其純度較高,有利于相關(guān)基礎(chǔ)研究的進(jìn)行,為小鼠成釉細(xì)胞的體外培養(yǎng)及純化提供了思路。第三章：Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR從mRNA水平證實(shí)了小鼠成釉細(xì)胞中Cdc42的存在,用Western blot從蛋白水平檢測(cè)了Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中的表達(dá),最后通過(guò)免疫熒光進(jìn)一步明確定位Cdc42主要表達(dá)于小鼠成釉細(xì)胞胞膜與胞質(zhì)位置,為以后探討Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中所發(fā)揮生物學(xué)功能影響奠定了基礎(chǔ)。第四章：抑制Cdc42對(duì)小鼠成釉細(xì)胞釉基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用Cdc42抑制劑ML141培養(yǎng)小鼠成釉細(xì)胞,達(dá)到抑制細(xì)胞中Cdc42。再通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠成釉細(xì)胞中釉基質(zhì)蛋白表達(dá)水平,從而初步探尋Cdc42對(duì)釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程可能發(fā)揮的作用。材料與方法小鼠牙胚切片的制作分別獲取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5組織標(biāo)本。將標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定后,再通過(guò)50%、70%、80%、90%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%I、100%Ⅱ的乙醇溶液中按由低到高梯度濃度達(dá)到脫水目的。脫水完成的標(biāo)本放入二甲苯中透明,再置于60℃的蠟中浸蠟。浸蠟后的組織按照切片需要方向包埋出蠟塊。石蠟切片機(jī)上5 μm連續(xù)切片,撈片放入烤箱備用。HE染色將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,之后依次經(jīng)過(guò)由低到高梯度濃度乙醇溶液復(fù)水。蘇木精染核,鹽酸酒精溶液分化脫色,流水返藍(lán),鏡下觀察至合適深度后浸入伊紅溶液中染色。復(fù)染好的組織切片再次經(jīng)過(guò)脫水透明步驟,最后樹膠封片,正置顯微鏡下觀察。組織免疫熒光將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,之后依次經(jīng)過(guò)梯度濃度乙醇溶液復(fù)水。蒸餾水洗滌之后,運(yùn)用枸櫞酸鈉溶液進(jìn)行抗原熱修復(fù)。再通過(guò)BSA封閉液封閉非特異性抗原。一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗及Hoechst避光室溫孵育后,熒光防淬滅甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。小鼠成釉細(xì)胞離體培養(yǎng)取新生小鼠脫頸處死浸泡于75%酒精中消毒后,沿上下頜骨中線將頭部分為上下兩部分,置于預(yù)冷無(wú)菌的D-Hanks溶液中清洗,于體視顯微鏡下完整分離上下頜中的第一磨牙牙胚。將牙胚收集加入0.25%含有EDTA的胰酶中,剪碎并37℃消化20 mmin,每5 mmin鐘搖晃一次以促進(jìn)胰酶作用均勻。將所得細(xì)胞懸液1000r/min離心5 mmin,棄去上清,用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,接種于用0.25 mg/mL Geltrex Matrix包被的培養(yǎng)皿中,置于37℃、50%C02飽和度和飽和濕度標(biāo)準(zhǔn)條件的孵箱中,隔天換液。小鼠成釉細(xì)胞純化利用上皮與間充質(zhì)兩種細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶耐受力的不同,取原代培養(yǎng)4d細(xì)胞,吸出培養(yǎng)基,用無(wú)菌的D-Hanks溶液清洗細(xì)胞后,加入0.25%胰蛋白酶,在倒置顯微鏡下觀察至長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞邊緣收縮,而上皮樣細(xì)胞并無(wú)明顯變化,此時(shí)加入培養(yǎng)基中止消化,并輕輕淋洗貼壁細(xì)胞,然后加入全培繼續(xù)培養(yǎng)。一周后重復(fù)差別消化,連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞免疫熒光將細(xì)胞消化后并種植于細(xì)胞爬片上,培養(yǎng)1d后,用無(wú)菌的D-Hanks溶液清洗,4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min, PBS溶液清洗3次,每次5 mmin,0.1% TritonX-100孵育5 min后PBS清洗,5%的BSA室溫封閉1h,一抗(K14和AMELX)孵育4℃過(guò)夜,PBS洗3次,每次5一mmin,紅色熒光二抗室溫孵育1h, Hochest復(fù)染細(xì)胞核,最后用熒光防淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察。RT-PCR提取細(xì)胞總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增,并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳跑膠,放入激光成像系統(tǒng)中觀察。Western blot常規(guī)提取細(xì)胞的蛋白,采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白的濃度,并將各樣品蛋白濃度調(diào)至相同。分別配好分離膠與濃縮膠、上樣、倒入電泳緩沖液進(jìn)行電泳跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、依次孵育一二抗、最后顯影液曝光,觀察記錄結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)值采用Mean±SD記錄,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用One Way ANOVA比較多組差異性,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)情況免疫熒光方法檢測(cè)到Cdc42在小鼠牙胚蕾狀期、帽狀期、鐘狀期及鐘狀晚期都有表達(dá),在釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中在成釉器中有不同程度的表達(dá)。2.小鼠成釉細(xì)胞的離體培養(yǎng)及純化原代培養(yǎng)的小鼠成釉細(xì)胞生長(zhǎng)良好,其中混有大量成纖維樣細(xì)胞,經(jīng)改良純化后明顯好轉(zhuǎn),細(xì)胞呈鋪路石樣成片生長(zhǎng),細(xì)胞純度較高。3.Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中的表達(dá)情況RT-PCR顯示Cdc42 mRNA在小鼠成釉細(xì)胞中表達(dá),Western blot顯示Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中檢測(cè)到表達(dá),細(xì)胞免疫熒光顯示Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中表達(dá)并定位于胞膜與胞質(zhì)。4.抑制Cdc42對(duì)小鼠成釉細(xì)胞釉基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響運(yùn)用Cdc42抑制劑ML141培養(yǎng)小鼠成釉細(xì)胞,達(dá)到抑制Cdc42的效果。通過(guò)Western blot檢測(cè)到小鼠成釉細(xì)胞釉基質(zhì)蛋白有不同程度的變化。結(jié)論1.Cdc42在各階段小鼠牙胚尤其成釉器中有不同程度表達(dá)變化,表明Cdc42可能參與釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程。2.采用基底膜抽提物作為基質(zhì),酶消化法培養(yǎng)后經(jīng)差速消化法純化得到小鼠成釉細(xì)胞,有利于相關(guān)基礎(chǔ)研究的進(jìn)行。3.小鼠成釉細(xì)胞中表達(dá)Cdc42,其主要表達(dá)于小鼠成釉細(xì)胞胞膜與胞質(zhì),提示Cdc42與成釉細(xì)胞有密切聯(lián)系。4.當(dāng)Cdc42受到抑制,小鼠成釉細(xì)胞中AMELX、AMBN、MMP20以及KLK4都出現(xiàn)了不同程度的變化,提示Cdc42可能影響小鼠成釉細(xì)胞釉基質(zhì)蛋白的表達(dá)情況。
【關(guān)鍵詞】：小鼠 成釉細(xì)胞 cdc42 釉基質(zhì)蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-20
• 第一章 Cdc42在小鼠牙胚發(fā)育中的表達(dá)20-28
• 1. 材料與方法20-23
• 2. 結(jié)果23-26
• 3. 討論26-28
• 第二章 小鼠成釉細(xì)胞離體培養(yǎng)、純化及鑒定28-37
• 1. 材料與方法28-32
• 2. 結(jié)果32-35
• 3. 討論35-37
• 第三章 Cdc42在小鼠成釉細(xì)胞中的表達(dá)37-47
• 1. 材料與方法37-43
• 2. 結(jié)果43-44
• 3. 討論44-47
• 第四章 抑制Cdc42對(duì)小鼠成釉細(xì)胞釉基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響47-56
• 1. 材料與方法47-51
• 2. 結(jié)果51-53
• 3. 討論53-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 成果61-62
• 致謝62-64

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