本文關(guān)鍵詞：運用不同的接種方法構(gòu)建組織工程化骨修復(fù)頜骨缺損的實驗研究

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【摘要】：目的將種子細胞接種至三維多孔支架上是構(gòu)建組織工程骨的第一步,也是最重要的一步。但目前常用的接種方法所構(gòu)建的組織工程細胞／支架復(fù)合體存在著種子細胞數(shù)量有限、細胞在支架上的分布不均以及支架血管化過程延期完成等三大缺點,極大的制約了骨組織工程技術(shù)的發(fā)展。因此有必要改良現(xiàn)有的骨組織工程接種方法以提高細胞的接種效率、促進種子細胞在支架上的均勻分布以及提高支架在體內(nèi)的礦化和血管化程度,使骨組織工程技術(shù)更有效地服務(wù)于臨床需要。在本文第一部分研究中,我們構(gòu)建了殼聚糖／β-磷酸三鈣復(fù)合支架并對其生物相容性進行檢測。在體內(nèi)正常的骨愈合過程中,干細胞會通過血液循環(huán)源源不斷的遷移到創(chuàng)傷部位來補充凋亡損失的成骨細胞來保證骨修復(fù)過程的持續(xù)進行。而目前的組織工程技術(shù)均是一次接種細胞至支架材料上,不能有效模擬機體的骨創(chuàng)傷愈合過程。因此,在第二部分研究中,我們嘗試運用多次接種構(gòu)建細胞／支架復(fù)合體,并比較多次接種和單次接種法在細胞增殖分布和骨形成效果方面的差異。單純依靠液體的滲透難以將種子細胞接種至支架內(nèi)部,在第三部分研究中,我們創(chuàng)新性的改良了正壓輔助動態(tài)接種法,并運用正壓輔助動態(tài)接種和雙面靜態(tài)接種法將兔骨髓基質(zhì)干細胞接種至殼聚糖／β-磷酸三鈣復(fù)合支架材料上,并比較兩種接種方法在細胞增殖和分布、支架的礦化和血管化程度方面的效果差異。方法1-骨組織工程復(fù)合支架的制備與生物相容性檢測(1).冷凍干燥法制備殼聚糖／p-磷酸三鈣復(fù)合支架。(2).全骨髓貼壁法提取、培養(yǎng)并鑒定骨髓基質(zhì)干細胞。(3).掃描電鏡檢測CS/β-TCP復(fù)合支架孔徑大小。(4).阿基米德法計算CS/β-TCP復(fù)合支架孔隙率。(5).CCK-8試劑盒檢測不同濃度的CS/β-TCP支架材料浸提液對MSCs活性的影響。(6).丫啶橙染色、熒光顯微鏡觀察試培養(yǎng)MSCs在CS/β-TCP支架上的生存狀態(tài)。2.多次與單次接種法所制備的組織工程骨在細胞增殖、分布及體內(nèi)新骨量等方面的比較(1).將7.2×105MSCs分三次、二次、一次接種至CS/β-TCP復(fù)合支架上,分為三次組(Group 3T)、二次組(Group 2T)和一次組(Group 1T)。接種1小時后計算各組MSCs的初始接種率。(2).接種24小時后行成骨定向誘導(dǎo),于誘導(dǎo)后第3,5,8和12天用CCK-8試劑盒檢測各組MSCs活性并繪制細胞增殖活性曲線圖。(3).成骨誘導(dǎo)后0、7、14、21和28天檢測各組細胞／支架復(fù)合體上的總DNA和總蛋白含量,并檢測堿性磷酸酶活性大小,繪制總DNA含量曲線圖和ALP活性曲線圖。(4).為了驗證多次和單次接種法對支架上的MSCs成骨分化能力影響與否,在成骨誘導(dǎo)后第0、7、14、21和28天行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)檢測各組細胞／支架復(fù)合體上成骨標志物骨鈣蛋白,骨粘連蛋白和骨橋蛋白的基因表達水平。(5).在成骨誘導(dǎo)后0、14和28天,對各組細胞／支架復(fù)合體上的細胞行碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架中心區(qū)域細胞數(shù)量和分布均勻程度。(6).制備兔下頜骨缺損模型,將各組細胞／支架復(fù)合體植入缺損處。分別于術(shù)后8和16周處死動物,取缺損部位標本行X線和Masson染色觀察各組下頜骨缺損修復(fù)和改建情況。3.正壓輔助動態(tài)接種與雙面靜態(tài)接種法所制備的組織工程骨在細胞增殖、分布及血管形成效果方面的比較(1).注射器活塞正壓抽吸10,20,40和60次分別將7.85×105MSCs接種至CS/β-TCP復(fù)合支架上,對照組支架則從雙側(cè)表面滴加相同數(shù)量細胞,在接種后1小時計算各組MSCs的初始接種率。同時,為了驗證注射器活塞產(chǎn)生的壓力對MSCs活性的影響與否,在接種后0,3,5,8和12天用CCK-8試劑盒檢測各組MSCs活性并繪制細胞增殖活性曲線圖。(2).在接種后0、7和14天,對各組細胞／支架復(fù)合體上的細胞行PI染色,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察在體外培養(yǎng)條件下支架中心區(qū)域的MSCs數(shù)量和分布均勻程度。(3).將各組細胞／支架復(fù)合體植入裸鼠背部皮下,分別于術(shù)后2,4和6周取出細胞／支架復(fù)合體行冰凍切片。DAPI染色,熒光顯微鏡觀察在體內(nèi)培養(yǎng)條件下正壓輔助接種法對支架內(nèi)部細胞的增殖和分布的影響。(5). Voncossa染色檢測正壓輔助接種法對細胞／支架復(fù)合體異位成骨的影響。(6).CD31免疫熒光染色檢測正壓輔助接種法對細胞／支架復(fù)合體血管化的影響。結(jié)果(1).冷凍干燥法制備的CS/β-TCP比例4：2.7的復(fù)合支架,其孔徑范圍為80μm-130gm左右；其孔隙率為(87.5±4.1)%；各種濃度的復(fù)合支架材料浸提液對細胞無毒性；將骨髓基質(zhì)干細胞接種至支架上試培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)細胞／材料復(fù)合體上細胞生長狀態(tài)良好。另外,提取培養(yǎng)的兔骨髓細胞能在定向誘導(dǎo)下向成骨、成軟骨和成脂方向分化且具有成纖維細胞集落形成單位,為骨髓基質(zhì)干細胞。(2).三次接種法的初始接種率能達到81.9%±0.03%,大于二次接種法的71.5%±0.02%和一次接種法的60.3%±0.06%。WST-8結(jié)果顯示三次組的細胞活性在第3、5天里低于、但是到第8天高于一次和二次組。這種趨勢一直持續(xù)到第12天。除了第12天外,二次組MSCs/CS/β-TCP復(fù)合體上的MSCs的活性在整個培養(yǎng)期間均高于一次組�？侱NA含量顯示一次組的細胞總DNA含量在成骨誘導(dǎo)0天較二次和三次組高,到成骨誘導(dǎo)7天時,二次組的細胞數(shù)量等于一次組,略大于三次組。到成骨誘導(dǎo)第14和21天時,二次組細胞數(shù)遠大于一次組和三次組。到成骨誘導(dǎo)28天時,三次組細胞數(shù)明顯大于二次和一次組。通過共聚焦顯微鏡觀察細胞在支架內(nèi)部的數(shù)量和分布情況,一次組細胞數(shù)量、細胞分布均勻程度在成骨誘導(dǎo)0天時均大于二次組和三次組。到成骨誘導(dǎo)第14天時,二次組和三次組的細胞數(shù)量大于一次組。而二次和三次組支架上細胞分布均勻程度大于一次組并一直持續(xù)。到成骨誘導(dǎo)第28天,三次組的細胞數(shù)量開始大于二次組。RT-PCR技術(shù)來檢測MSCs/CS/β-TCP復(fù)合體上OC,ON和OP的表達,來驗證單次和多次接種法是否會影響MSCs成骨分化能力。在整個培養(yǎng)期間,三次組和二次組支架上的MSCs的OC,ON和OP表達量均大于一次組。X線片顯示三次組和二次組缺損處骨密度在術(shù)后8、16周均大于一次組。Masson染色結(jié)果顯示三次組新骨形成和改建速度最快,二次組其次,一次組最慢。(3).靜態(tài)雙面接種法初始接種率為79.42±9.87%；10次的正壓抽吸組接種效率較雙面組低,為53.74±9.96%；隨著正負壓抽吸次數(shù)的增加,初始接種率也不斷提高。20次的正壓抽吸接種能達到92.63%±3.17%接種率,接種效率明顯大于雙面組；而40次和60次的正負壓抽吸更是分別達到了95.26±4.78%,和97.14%士1.30%的初始接種效率。但是CCK-8細胞活性結(jié)果顯示40次和60次的正壓抽吸極大的影響細胞活性。20次組能同時達到一個相對較高的初始接種率和細胞活性,因此正壓輔助接種法的抽吸次數(shù)在后續(xù)試驗均選擇20次的正壓抽吸。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示正壓輔助抽吸20次組無論是在細胞數(shù)量還是在細胞分布均勻程度方面均要優(yōu)于雙面組。把各組細胞／支架復(fù)合體植入裸鼠體內(nèi)2,4和6周后,熒光顯微鏡觀察到正壓輔助組在細胞數(shù)量和分布均勻程度方面均高于雙面組。Voncossa染色結(jié)果顯示正壓輔助組在支架異位礦化程度均高于雙面組和對照組。CD31免疫熒光染色顯示正壓輔助組在支架程度方面均高于雙面組和對照組。結(jié)論(1).本實驗所制備的CS/β-TCP復(fù)合支架具備合適的孔徑和孔隙率,良好的生物相容性和親水性良好,滿足骨組織工程支架要求。(2).相比單次接種法,多次接種法有以下幾點優(yōu)勢：(1).提高細胞初始接種率；(2).促進細胞增殖；(3).提高細胞在支架材料上的分布均勻程度；(4).促進材料吸收；(5).促進骨形成和骨改建。(3).本實驗研究所改進的正壓輔助接種法能提高種子細胞的接種效率；促進種子細胞的增值；提高細胞在支架上的均勻分布程度；促進支架在體內(nèi)的異位礦化；促進支架內(nèi)部的血管新生,為骨組織工程實驗研究提供了一種簡易、高效的動態(tài)接種方法。
【關(guān)鍵詞】：骨組織工程 接種方法 骨髓基質(zhì)干細胞 骨形成 骨改建 血管形成
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R782.4;R318.08
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• ABSTRACT14-19
• 緒論19-33
• 1 文獻綜述一：骨骼解剖與組織結(jié)構(gòu)19-26
• 2 文獻綜述二：骨組織工程接種方法概述26-31
• 3 小結(jié)31-33
• 第一部分 CS/β-TCP復(fù)合支架的制備及生物相容性檢測33-47
• 1. 引言33-34
• 2. 實驗材料34-36
• 3. 實驗方法36-42
• 4. 實驗結(jié)果42-45
• 5. 討論45-46
• 6. 結(jié)論與展望46-47
• 第二部分 多次接種促進骨形成和骨改建47-67
• 1. 引言47
• 2. 實驗材料47-49
• 3. 實驗方法49-56
• 4. 實驗結(jié)果56-62
• 5. 討論62-65
• 6. 結(jié)論與展望65-67
• 第三部分 改良正壓輔助接種法對種子細胞在支架材料上的分布、礦化和血管化的影響67-85
• 1. 引言67
• 2. 實驗材料67-69
• 3. 實驗方法69-75
• 4. 實驗結(jié)果75-81
• 5. 討論81-84
• 6. 結(jié)論與展望84-85
• 參考文獻85-95
• 個人簡介95-97
• 攻博期間發(fā)表的科研成果目錄97-99
• 致謝99-100

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