本文關(guān)鍵詞：多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2對(duì)口腔癌發(fā)生發(fā)展作用的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： Oct4 Sox2 口腔癌 細(xì)胞重編程 致瘤

【摘要】：口腔癌是口腔黏膜上皮來(lái)源的惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程。目前,腫瘤的起源普遍認(rèn)為是體內(nèi)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變引起的,并且所有細(xì)胞積累突變的概率是均等的。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)的提出為腫瘤的來(lái)源帶來(lái)了新的理解。腫瘤中存在一小群具有自我更新能力的細(xì)胞,這群細(xì)胞能夠起始腫瘤,并維持腫瘤的生長(zhǎng)和異質(zhì)性,被稱為腫瘤干細(xì)胞或者腫瘤起始細(xì)胞。由于腫瘤起始細(xì)胞和多能干細(xì)胞一樣都能夠進(jìn)行自我更新和特異分化,因此有人認(rèn)為腫瘤起始細(xì)胞和多能干細(xì)胞具有某種相似性。通過研究多能干細(xì)胞因子與口腔癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系,從而為進(jìn)一步探討口腔癌的起源提供可能。細(xì)胞重編程可以在一定條件下通過改變細(xì)胞基因表達(dá)程序的差異,使體細(xì)胞的遺傳記憶被清除,重新程序化產(chǎn)生新的表型和功能,恢復(fù)細(xì)胞的多能性。體細(xì)胞在被外源性導(dǎo)入Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4(OSCK)之后可以被重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i PSCs),這四種因子被稱為多能干細(xì)胞因子,然而有人同樣利用該四種重編程因子得到卻是腫瘤的表型。由此可見,重編程i PSCs的過程和腫瘤產(chǎn)生的過程有著某種內(nèi)在的聯(lián)系。在OSCK這四種重編程因子中c-Myc作為原癌基因,本身可以引起p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和衰老,而Klf4抑制了p53的表達(dá),從而中和了c-Myc的凋亡作用,因此重編程i PSCs的全能性是由Oct4和Sox2轉(zhuǎn)染獲得的。近來(lái)研究表明Oct4和Sox2基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但細(xì)胞是否在Oct4和Sox2的作用下,發(fā)生了部分重編程導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,目前為止尚無(wú)明確結(jié)論。本課題將從以下四個(gè)部分通過實(shí)驗(yàn)研究分別探討Oct4和Sox2在正�？谇火つず涂谇话┑谋磉_(dá)差異,以及對(duì)口腔上皮細(xì)胞和口腔癌細(xì)胞的致瘤作用,從而為今后口腔癌的防治提供新的思路。第一部分:Oct4和Sox2在口腔黏膜癌變過程中的表達(dá)情況目的:了解正�？谇火つ�、口腔癌前病變(或病損)以及口腔癌中Oct4和Sox2的表達(dá)情況。方法:利用4-硝基喹啉-1-氧化物誘導(dǎo)小鼠口腔黏膜上皮產(chǎn)生增生,建立類癌前病變的動(dòng)物模型(20例),以及正常小鼠的口腔黏膜(20例)作為對(duì)照,同時(shí)在臨床收集口腔白斑(20例)、口腔扁平苔癬(20例)以及口腔鱗狀細(xì)胞癌(40例)的病理組織蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色分析,初步判斷Oct4和Sox2在各組組織的表達(dá)情況。結(jié)果:HE染色顯示小鼠癌前病變模型建立成功,在小鼠正常黏膜中Oct4和Sox2可單獨(dú)出現(xiàn),卻不能同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)樣本;在小鼠的變異黏膜中Oct4和Sox2同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)樣本的情況占70%;在人口腔癌前病變(或病損)和口腔鱗狀細(xì)胞癌中Oct4和Sox2同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)樣本的情況分別為62.5%和65%。第二部分:多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2重編程口腔黏膜上皮細(xì)胞成瘤目的:探討Oct4和Sox2對(duì)永生化口腔上皮細(xì)胞h TERT+-OME的重編程致瘤作用。方法:制備慢病毒載體,分別將Oct4和Sox2轉(zhuǎn)入h TERT+-OME細(xì)胞,篩選后進(jìn)行細(xì)胞重編程。用重編程后的細(xì)胞在免疫缺陷小鼠(每組10只)體內(nèi)進(jìn)行異體移植瘤實(shí)驗(yàn),觀察各組小鼠的成瘤情況,并對(duì)所成腫瘤組織進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色分析定性。結(jié)果:h TERT+-OME細(xì)胞經(jīng)過Oct4和Sox2重編程過程,得到三組新細(xì)胞:h TERT+-O+-OME、h TERT+-S+-OME以及h TERT+-OS+-OME。僅h TERT+-OS+-OME細(xì)胞在小鼠皮下形成腫瘤,腫瘤平均質(zhì)量=0.1249±0.0162g。HE染色顯示:腫瘤有類腺管樣特征,并且侵入了臨近的骨骼肌組織。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明:CK5、CK19,Vimentin、Ki67、Oct4和Sox2陽(yáng)性;CD31和Calponin陰性。第三部分:多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2對(duì)口腔癌細(xì)胞成瘤作用的研究目的:進(jìn)一步探討Oct4和Sox2對(duì)口腔癌細(xì)胞的致瘤作用以及它們之間的相互關(guān)系。方法:建立人牙齦癌原代培養(yǎng)細(xì)胞系Gca1551,同時(shí)采用人舌鱗癌細(xì)胞系Cal27作為生物重復(fù)參考。構(gòu)建慢病毒載體,利用sh-RNA技術(shù)分別干擾兩個(gè)口腔癌細(xì)胞系中Oct4和Sox2的表達(dá),流式細(xì)胞儀篩選后,建立6株新的細(xì)胞Gca1551-Olow,Gca1551-Slow,Gca1551-OlowSlow,Cal27-Olow,Cal27-Slow和Cal27-OlowSlow。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Oct4和Sox2表達(dá)情況。各組細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行異體移植瘤實(shí)驗(yàn),觀察各組小鼠的成瘤情況,并對(duì)所成腫瘤組織進(jìn)行HE染色分析。Western blot檢測(cè)各組腫瘤組織中相關(guān)蛋白(Oct4,Sox2,Ki67,Snail和VEGF)的表達(dá)情況。結(jié)果:Oct4蛋白在所有Oct4low細(xì)胞中表達(dá)有所降低,在單獨(dú)Sox2low的細(xì)胞中也有略微降低;Sox2蛋白在所有Sox2low細(xì)胞中表達(dá)降低,而在單獨(dú)Oct4low細(xì)胞中表達(dá)有所上升。成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sox2low和Oct4lowSox2low細(xì)胞所成腫瘤與對(duì)照組相比體積、質(zhì)量、惡性程度以及相關(guān)因子的表達(dá)程度(Ki67,Snail和VEGF)均有所下降;而Oct4low細(xì)胞所成腫瘤的各項(xiàng)指標(biāo)卻略有上升。第四部分:多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2對(duì)口腔上皮細(xì)胞及口腔癌細(xì)胞致瘤作用機(jī)制的研究目的:探討Oct4和Sox2對(duì)口腔上皮細(xì)胞和口腔癌細(xì)胞致瘤作用機(jī)制。方法:采用高通量測(cè)序的方法,檢測(cè)8株細(xì)胞(h TERT+-OME、h TERT+-O+-OME、h TERT+-S+-OME、h TERT+-OS+-OME、Gca1551、Gca1551-Olow、Gca1551-Slow和Gca1551-OlowSlow)中l(wèi)nc RNA以及所對(duì)應(yīng)的m RNA的表達(dá)情況,再利用同源細(xì)胞在相同的遺傳背景下,對(duì)比尋找轉(zhuǎn)入和敲除Oct4和Sox2以后的共同差異m RNA,從而初步探明Oct4和Sox2對(duì)口腔腫瘤發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用時(shí)所調(diào)控的靶基因。結(jié)果:經(jīng)過對(duì)8組樣本的測(cè)序、篩選,一共檢測(cè)出3371個(gè)可供分析的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)比雙轉(zhuǎn)和雙敲Oct4和Sox2后的共同差異轉(zhuǎn)錄本為52條,其中對(duì)應(yīng)的RHEBL1和RPS19差異較明顯。經(jīng)過RT-PCR驗(yàn)證RHEBL1和RPS19無(wú)論在雙轉(zhuǎn)了Oct4和Sox2的可致瘤口腔上皮細(xì)胞系中,還是在尚未敲除Oct4和Sox2的口腔癌細(xì)胞系中均出現(xiàn)了異常的高表達(dá)情況。結(jié)論:1、Oct4和Sox2能夠在口腔癌前病變和癌組織中同時(shí)表達(dá)在同一個(gè)細(xì)胞,而在正�？谇火つそM織中卻不能同時(shí)表達(dá)。2、Oct4和Sox2能夠重編程口腔上皮細(xì)胞h TERT+-OME為腫瘤細(xì)胞h TERT+-OS+-OME,并且在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤。3、Oct4和Sox2在促進(jìn)口腔腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程中是一個(gè)相互作用、相互影響的有機(jī)體,其中Oct4是起始腫瘤的關(guān)鍵因子,Sox2是影響腫瘤性質(zhì)的關(guān)鍵因子。4、Oct4和Sox2在口腔腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中,可能是通過lnc RNA調(diào)控下游的RHEBL1和RPS19等m RNA從而發(fā)揮了促瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：Oct4 Sox2 口腔癌 細(xì)胞重編程 致瘤
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.8
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-16
• 符號(hào)說(shuō)明（縮略詞）16-17
• 前言17-20
• 參考文獻(xiàn)18-20
• 第一部分：Oct4和Sox2在口腔黏膜癌變過程中的表達(dá)情況20-37
• 1 引言20-21
• 2 材料與方法21-26
• 3 結(jié)果26-32
• 4 討論32-35
• 5 小結(jié)35
• 6 參考文獻(xiàn)35-37
• 第二部分：多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2重編程口腔黏膜上皮細(xì)胞成瘤37-58
• 1 引言37-38
• 2 材料和方法38-49
• 3 結(jié)果49-53
• 4 討論53-55
• 5 小結(jié)55-56
• 6 參考文獻(xiàn)56-58
• 第三部分：多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2對(duì)口腔癌細(xì)胞成瘤作用的研究58-82
• 1 引言58-59
• 2 材料和方法59-71
• 3 結(jié)果71-76
• 4 討論76-79
• 5 小結(jié)79
• 6 參考文獻(xiàn)79-82
• 第四部分：多能干細(xì)胞因子Oct4和Sox2對(duì)口腔上皮細(xì)胞及口腔癌細(xì)胞致瘤作用機(jī)制的研究82-110
• 1 引言82-83
• 2 材料和方法83-94
• 3 結(jié)果94-104
• 4 討論104-106
• 5 小結(jié)106
• 6 參考文獻(xiàn)106-110
• 全文總結(jié)110-111
• 課題展望111-112
• 綜述 多能干細(xì)胞因子 Oct4 和 Sox2 在干細(xì)胞及腫瘤中作用的研究現(xiàn)狀112-128
• 參考文獻(xiàn)122-128
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文128-129
• 致謝129

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本文編號(hào)：947795