發(fā)布時間：2017-09-23 05:45

  本文關(guān)鍵詞：體外連續(xù)培養(yǎng)人牙髓干細胞干性特征改變的相關(guān)研究

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【摘要】：牙髓干細胞(Dental pulp stem cell,DPSCs)是成體干細胞(Adult-derived stem celsl,ASCs)家族的重要成員之一,起源于神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細胞[1],是從牙髓組織中提取分離出來的少量具有干細胞特性的未分化細胞。特定誘導(dǎo)條件下可定向分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細胞[2]。因其具有較骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)更高的分化程度,以及取材簡單,創(chuàng)傷小,來源廣泛,較強的分化潛能和自我更新能力[3],目前被認為是組織工程學理想的種子細胞。但原代培養(yǎng)獲得人牙髓干細胞數(shù)量有限,須經(jīng)體外擴增才能獲得足夠的種子細胞,而已有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下會出現(xiàn)不同程度的衰老,有關(guān)牙髓干細胞體外連續(xù)傳代后生物學活性的改變尚不明確。研究目的:本研究旨在通過觀察牙髓干細胞在體外連續(xù)傳代后細胞增殖、分化和自我更新能力等的變化,以探究體外培養(yǎng)環(huán)境對牙髓干細胞干性的影響,為研究干細胞干性維持機制以及指導(dǎo)牙髓干細胞組織工程學臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。實驗方法和結(jié)果如下:1.人牙髓干細胞(Human Dental Pulp Stem Cells,HDPSCs)分離、培養(yǎng)、純化和鑒定采用I型膠原酶消化結(jié)合組織塊貼壁法分離獲得人原代牙髓細胞(Human Dental Pulp Cells,HDPCs),有限稀釋法挑選單克隆純化牙髓細胞;流式細胞儀檢測表明細胞高表達CD29、CD90、CD105、CD146和Stro-1表面標記分子,但CD34、CD45表達陰性,說明所獲細胞來源于間充質(zhì);茜素紅染色、ALP染色和油紅O染色陽性結(jié)果證實細胞具有向成牙本質(zhì)/成骨細胞以及成脂細胞分化能力,實驗結(jié)果表明已成功培養(yǎng)獲得h DPSC。2.連續(xù)傳代對h DPSCs形態(tài)、細胞表型以及衰老的影響體外二維條件培養(yǎng)h DPSCs并連續(xù)傳代,分別以P4、P8、P12、P16、P20 h DPSCs為研究對象,結(jié)果顯示:(1)P4 h DPSCs形小、呈圓形,隨著代數(shù)的增加,細胞形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則,體積變大。(2)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)各代h DPSCs表面標記物CD29、CD90表達無明顯差異(P0.05),而與間充質(zhì)干細胞密切相關(guān)的CD105、CD146表達隨代數(shù)增加逐漸降低(P0.05)。(3)SA-β-半乳糖苷酶染色顯示P4 h DPSCs無明顯的衰老現(xiàn)象,但P16、P20衰老細胞比例顯著上調(diào)(P0.01)。3.體外連續(xù)培養(yǎng)h DPSCs增殖、分化以及克隆形成能力的影響(1)MTT檢測結(jié)果顯示P4 h DPSCs增殖最快,隨后增殖能力逐代降低(P0.05)。細胞周期結(jié)果顯示各代S期細胞所占總細胞數(shù)比例隨代數(shù)增加呈現(xiàn)降低趨勢。(2)分化能力檢測發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)各代h DPSCs成牙本質(zhì)/成骨細胞向分化14天,茜素紅著色隨代數(shù)的增加逐漸變淺,鏡下觀礦化結(jié)節(jié)數(shù)減少,Real-time PCR檢測顯示成牙本質(zhì)細胞分化標記蛋白DSPP,RUNX2 m RNA表達水平隨代數(shù)的增加而降低(P0.05)。體外誘導(dǎo)h DPSCs成脂向分化30天,油紅O染色結(jié)果顯示脂滴形成數(shù)隨代數(shù)的增加而減少,Real-Time PCR檢測PPAR-γ隨代數(shù)的增加而降低(P0.05)。(3)甲苯胺藍染成纖維細胞集落形成率(Colony forming unit fibroblastic,CFU-F)實驗顯示隨代數(shù)的增加,克隆結(jié)節(jié)形成數(shù)目逐漸減少,表明h DPSCs隨體外傳代次數(shù)的增加克隆形成能力降低,自我更新能力減弱。(4)RT-PCR檢測各代h DPSCs內(nèi)生長因子IGF-2、TGF-β、HGF、FGF-2、VEGF、EGF、FGF-4、IL-6表達情況,結(jié)果顯示FGF、TGF-β隨代數(shù)增加表達減少,IGF-2、HGF、VEGF表達在P8 h DPSCs時顯著增強,HGF在P20 h DPSCs中出現(xiàn)一過性的高表達,h DPSCs不表達EGF、FGF-4、IL-6。4.連續(xù)傳代對干性相關(guān)因子表達的影響(1)Real-time PCR檢測各代h DPSCs Oct4可變剪接體(Oct4A,Oct4B)以及干性分子(Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog)表達改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪接體Oct4A和干性分子(Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog)在h DPSCs中表達,Oct4A表達量隨代數(shù)增加無明顯變化(P0.05),而c-Myc表達顯著上調(diào)后又逐漸下調(diào),干性基因Sox2,Klf4和Nanog表達隨代數(shù)增加呈降低趨勢(P0.05),但各代h DPSCs剪接體Oct4B表達均為陰性。(2)激光共聚焦顯微鏡觀察連續(xù)傳代Oct4A定位改變,發(fā)現(xiàn)P4、P8 h DPSC中,Oct4A主要表達于細胞核,P12 h DPSCs中Oct4A表達逐漸從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位。P16、P20 h DPSCs中Oct4A表達主要定位于胞漿,提示Oct4A轉(zhuǎn)位可能與干細胞干性的減弱有關(guān)。綜上所述,本研究初步證明h DPSCs在體外擴增培養(yǎng)過程中其增殖、成牙本質(zhì)/成骨向分化能力、自我更新能力等干性特征逐漸減弱,進一步研究發(fā)現(xiàn),干性相關(guān)分子中Sox2、Klf4和Nanog表達隨代數(shù)增加呈降低趨勢,而Oct4可變剪接體Oct4A表達量隨代數(shù)增加雖無明顯改變但出現(xiàn)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位,提示可能干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A可能在h DPSCs干性維持中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,本課題今后進一步的研究將集中探討干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A轉(zhuǎn)位改變的功能作用,以期尋找到維持h DPSCs干性的的關(guān)鍵機制,為h DPSCs在再生醫(yī)學中的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細胞 傳代 干性 衰老
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R781.3
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻回顧14-22
• 第一部分 人牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定22-30
• 1 材料22-23
• 2 方法23-25
• 3 結(jié)果25-28
• 4 討論28-30
• 第二部分 連續(xù)傳代對h DPSCs細胞生物學活性的影響30-44
• 1 材料30-31
• 2 方法31-35
• 3 結(jié)果35-41
• 4 討論41-44
• 第三部分 連續(xù)傳代對干性相關(guān)因子表達的影響44-52
• 1 材料44-45
• 2 實驗方法45-48
• 3 結(jié)果48-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻53-62
• 個人簡歷和研究成果62-63
• 致謝63

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 廖志清;;牙髓干細胞研究進展[J];中山大學研究生學刊(自然科學、醫(yī)學版);2008年03期

2 張映娟;陳文霞;;牙髓干細胞的可塑性研究[J];國際口腔醫(yī)學雜志;2009年05期

3 商麗娟;吳巖;;牙髓干細胞在組織工程研究中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究;2013年19期

4 郭紅延,吳補領(lǐng),郭希民,王常勇;大鼠牙髓干細胞的培養(yǎng)和鑒定[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2004年05期

5 王亦菁,史俊南,金巖;牙髓干細胞的研究和應(yīng)用展望[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2004年06期

6 張春艷,孫善珍,李紓;牙髓干細胞的研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2004年07期

7 郭紅延,王常勇,吳補領(lǐng);牙髓干細胞研究進展[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志;2005年05期

8 賀慧霞,史俊南,金巖,李鋒華;牙髓干細胞研究中的哲學思考[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2005年11期

9 何飛,譚穎徽,張綱;人牙髓干細胞的體外培養(yǎng)和鑒定[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2005年01期

10 侯延華;譚穎徽;姚韶武;何飛;張綱;王建華;;人牙髓干細胞體外二維和三維培養(yǎng)的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2006年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李昊妍;梁景平;張秀麗;殷德民;;人牙髓干細胞與β-TCP復(fù)合后的體內(nèi)外實驗研究[A];全國第三次牙體牙髓病學臨床技術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

2 李昊妍;梁景平;張秀麗;殷德民;;人牙髓干細胞與β-TCP復(fù)合后的體內(nèi)外實驗研究[A];全國第八次牙體牙髓病學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

3 鄒朝暉;沈靜燕;劉士有;;牙髓干細胞的研究進展及應(yīng)用(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學工程學會2006年學術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

4 賈謙;吳家媛;倪龍興;;堿性成纖維細胞生長因子對牙髓干細胞成骨分化的影響[A];全國第八次牙體牙髓病學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

5 呂長勝;翟旭;;大鼠牙髓干細胞分化成骨樣細胞能力研究[A];中華醫(yī)學會整形外科學分會第十一次全國會議、中國人民解放軍整形外科學專業(yè)委員會學術(shù)交流會、中國中西醫(yī)結(jié)合學會醫(yī)學美容專業(yè)委員會全國會議論文集[C];2011年

6 陸家瑜;華麗;鄒德榮;;乳牙牙髓干細胞體內(nèi)外誘導(dǎo)成骨的研究[A];中華口腔醫(yī)學會全科口腔醫(yī)學專業(yè)委員會第一次學術(shù)年會會議論文集[C];2009年

7 麻丹丹;高杰;吳補領(lǐng);;改良組織塊酶消化法培養(yǎng)人齲壞牙髓干細胞的實驗研究[A];全國第八次牙體牙髓病學學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 呂長勝;翟旭;;大鼠牙髓干細胞分化成骨樣細胞能力研究[A];中華醫(yī)學會整形外科學分會第十一次全國會議、中國人民解放軍整形外科學專業(yè)委員會學術(shù)交流會、中國中西醫(yī)結(jié)合學會醫(yī)學美容專業(yè)委員會全國會議論文集[C];2011年

9 申元源;陳柯;許諾;;人乳牙牙髓干細胞體外誘導(dǎo)向軟骨細胞分化的實驗研究[A];全國第三次牙體牙髓病學臨床技術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

10 鄭穎;王松靈;;小型豬乳牙牙髓干細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定[A];全國第三次牙體牙髓病學臨床技術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 記者 張忠霞;用猴子牙髓干細胞能刺激腦細胞生長[N];新華每日電訊;2008年

2 羅剛;牙齒——實現(xiàn)器官再生夢想的先鋒[N];健康報;2007年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陸群;牙髓干細胞分離培養(yǎng)鑒定和體外誘導(dǎo)分化的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2002年

2 于金華;牙髓干細胞形成牙體組織能力及其制備嵌合體牙齒的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2007年

3 郭紅延;大鼠牙髓干細胞培養(yǎng)鑒定及生物學特性研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

4 賀慧霞;牙髓干細胞分離鑒定及其制備組織工程化牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

5 汪銀雄;用牙髓干細胞構(gòu)建牙齒樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

6 趙秀;MTA調(diào)控人牙髓干細胞分化的分子機制的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

7 張紅梅;微環(huán)境對牙髓干細胞成牙能力的影響及MAPK信號分子機制調(diào)控的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

8 麻丹丹;人深齲牙髓干細胞礦化相關(guān)蛋白質(zhì)組學分析及候選基因Stathmin功能的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2012年

9 劉影;Toll樣受體4對人牙髓天然免疫反應(yīng)調(diào)控的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

10 王亦菁;牙髓干細胞與外胚間充質(zhì)干細胞表型和分化能力的比較研究[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林j欽;Scleraxis對牙髓干細胞多向分化的影響[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 吳中明;TGF-β_3與牙髓干細胞聯(lián)合Bio-oss骨粉在動物骨缺損修復(fù)中的作用研究[D];石河子大學;2015年

3 賀瑩;體外連續(xù)培養(yǎng)人牙髓干細胞干性特征改變的相關(guān)研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

4 馬逢樂;MS-275對人牙髓干細胞增殖和分化的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

5 王放放;提高牙髓干細胞牙向分化潛能的研究[D];福建師范大學;2009年

6 鮑艷;重組腺病毒介導(dǎo)的人表皮生長因子基因體外轉(zhuǎn)染人牙髓干細胞的研究[D];瀘州醫(yī)學院;2012年

7 麻丹丹;牙髓干細胞與牙乳頭細胞生長分化調(diào)控因素的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

8 王利娟;炎癥微環(huán)境下牙髓干細胞生物學行為改變的機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2014年

9 王曉東;神經(jīng)營養(yǎng)素在人牙髓干細胞的表達及對細胞增殖分化的影響[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

10 王瑛慧;牙髓干細胞生物學特性及體外誘導(dǎo)重建牙髓組織的研究[D];吉林大學;2004年

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本文編號：903554