本文關(guān)鍵詞：體外連續(xù)培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞干性特征改變的相關(guān)研究

  更多相關(guān)文章： 牙髓干細(xì)胞 傳代 干性 衰老

【摘要】：牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cell,DPSCs)是成體干細(xì)胞(Adult-derived stem celsl,ASCs)家族的重要成員之一,起源于神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細(xì)胞[1],是從牙髓組織中提取分離出來的少量具有干細(xì)胞特性的未分化細(xì)胞。特定誘導(dǎo)條件下可定向分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細(xì)胞[2]。因其具有較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)更高的分化程度,以及取材簡(jiǎn)單,創(chuàng)傷小,來源廣泛,較強(qiáng)的分化潛能和自我更新能力[3],目前被認(rèn)為是組織工程學(xué)理想的種子細(xì)胞。但原代培養(yǎng)獲得人牙髓干細(xì)胞數(shù)量有限,須經(jīng)體外擴(kuò)增才能獲得足夠的種子細(xì)胞,而已有研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下會(huì)出現(xiàn)不同程度的衰老,有關(guān)牙髓干細(xì)胞體外連續(xù)傳代后生物學(xué)活性的改變尚不明確。研究目的:本研究旨在通過觀察牙髓干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代后細(xì)胞增殖、分化和自我更新能力等的變化,以探究體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)牙髓干細(xì)胞干性的影響,為研究干細(xì)胞干性維持機(jī)制以及指導(dǎo)牙髓干細(xì)胞組織工程學(xué)臨床應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:1.人牙髓干細(xì)胞(Human Dental Pulp Stem Cells,HDPSCs)分離、培養(yǎng)、純化和鑒定采用I型膠原酶消化結(jié)合組織塊貼壁法分離獲得人原代牙髓細(xì)胞(Human Dental Pulp Cells,HDPCs),有限稀釋法挑選單克隆純化牙髓細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90、CD105、CD146和Stro-1表面標(biāo)記分子,但CD34、CD45表達(dá)陰性,說明所獲細(xì)胞來源于間充質(zhì);茜素紅染色、ALP染色和油紅O染色陽(yáng)性結(jié)果證實(shí)細(xì)胞具有向成牙本質(zhì)/成骨細(xì)胞以及成脂細(xì)胞分化能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明已成功培養(yǎng)獲得h DPSC。2.連續(xù)傳代對(duì)h DPSCs形態(tài)、細(xì)胞表型以及衰老的影響體外二維條件培養(yǎng)h DPSCs并連續(xù)傳代,分別以P4、P8、P12、P16、P20 h DPSCs為研究對(duì)象,結(jié)果顯示:(1)P4 h DPSCs形小、呈圓形,隨著代數(shù)的增加,細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)椴灰?guī)則,體積變大。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各代h DPSCs表面標(biāo)記物CD29、CD90表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05),而與間充質(zhì)干細(xì)胞密切相關(guān)的CD105、CD146表達(dá)隨代數(shù)增加逐漸降低(P0.05)。(3)SA-β-半乳糖苷酶染色顯示P4 h DPSCs無(wú)明顯的衰老現(xiàn)象,但P16、P20衰老細(xì)胞比例顯著上調(diào)(P0.01)。3.體外連續(xù)培養(yǎng)h DPSCs增殖、分化以及克隆形成能力的影響(1)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示P4 h DPSCs增殖最快,隨后增殖能力逐代降低(P0.05)。細(xì)胞周期結(jié)果顯示各代S期細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)比例隨代數(shù)增加呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。(2)分化能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)各代h DPSCs成牙本質(zhì)/成骨細(xì)胞向分化14天,茜素紅著色隨代數(shù)的增加逐漸變淺,鏡下觀礦化結(jié)節(jié)數(shù)減少,Real-time PCR檢測(cè)顯示成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記蛋白DSPP,RUNX2 m RNA表達(dá)水平隨代數(shù)的增加而降低(P0.05)。體外誘導(dǎo)h DPSCs成脂向分化30天,油紅O染色結(jié)果顯示脂滴形成數(shù)隨代數(shù)的增加而減少,Real-Time PCR檢測(cè)PPAR-γ隨代數(shù)的增加而降低(P0.05)。(3)甲苯胺藍(lán)染成纖維細(xì)胞集落形成率(Colony forming unit fibroblastic,CFU-F)實(shí)驗(yàn)顯示隨代數(shù)的增加,克隆結(jié)節(jié)形成數(shù)目逐漸減少,表明h DPSCs隨體外傳代次數(shù)的增加克隆形成能力降低,自我更新能力減弱。(4)RT-PCR檢測(cè)各代h DPSCs內(nèi)生長(zhǎng)因子IGF-2、TGF-β、HGF、FGF-2、VEGF、EGF、FGF-4、IL-6表達(dá)情況,結(jié)果顯示FGF、TGF-β隨代數(shù)增加表達(dá)減少,IGF-2、HGF、VEGF表達(dá)在P8 h DPSCs時(shí)顯著增強(qiáng),HGF在P20 h DPSCs中出現(xiàn)一過性的高表達(dá),h DPSCs不表達(dá)EGF、FGF-4、IL-6。4.連續(xù)傳代對(duì)干性相關(guān)因子表達(dá)的影響(1)Real-time PCR檢測(cè)各代h DPSCs Oct4可變剪接體(Oct4A,Oct4B)以及干性分子(Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog)表達(dá)改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪接體Oct4A和干性分子(Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog)在h DPSCs中表達(dá),Oct4A表達(dá)量隨代數(shù)增加無(wú)明顯變化(P0.05),而c-Myc表達(dá)顯著上調(diào)后又逐漸下調(diào),干性基因Sox2,Klf4和Nanog表達(dá)隨代數(shù)增加呈降低趨勢(shì)(P0.05),但各代h DPSCs剪接體Oct4B表達(dá)均為陰性。(2)激光共聚焦顯微鏡觀察連續(xù)傳代Oct4A定位改變,發(fā)現(xiàn)P4、P8 h DPSC中,Oct4A主要表達(dá)于細(xì)胞核,P12 h DPSCs中Oct4A表達(dá)逐漸從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位。P16、P20 h DPSCs中Oct4A表達(dá)主要定位于胞漿,提示Oct4A轉(zhuǎn)位可能與干細(xì)胞干性的減弱有關(guān)。綜上所述,本研究初步證明h DPSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中其增殖、成牙本質(zhì)/成骨向分化能力、自我更新能力等干性特征逐漸減弱,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),干性相關(guān)分子中Sox2、Klf4和Nanog表達(dá)隨代數(shù)增加呈降低趨勢(shì),而Oct4可變剪接體Oct4A表達(dá)量隨代數(shù)增加雖無(wú)明顯改變但出現(xiàn)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位,提示可能干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A可能在h DPSCs干性維持中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,本課題今后進(jìn)一步的研究將集中探討干性分子Sox2、Klf4和Nanog以及Oct4A轉(zhuǎn)位改變的功能作用,以期尋找到維持h DPSCs干性的的關(guān)鍵機(jī)制,為h DPSCs在再生醫(yī)學(xué)中的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細(xì)胞 傳代 干性 衰老
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.3
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-22
• 第一部分 人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定22-30
• 1 材料22-23
• 2 方法23-25
• 3 結(jié)果25-28
• 4 討論28-30
• 第二部分 連續(xù)傳代對(duì)h DPSCs細(xì)胞生物學(xué)活性的影響30-44
• 1 材料30-31
• 2 方法31-35
• 3 結(jié)果35-41
• 4 討論41-44
• 第三部分 連續(xù)傳代對(duì)干性相關(guān)因子表達(dá)的影響44-52
• 1 材料44-45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 3 結(jié)果48-50
• 4 討論50-52
• 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果62-63
• 致謝63

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本文編號(hào)：903554