本文關(guān)鍵詞：牙囊細(xì)胞通過(guò)RUNX2-MiR-31-SATB2環(huán)路調(diào)節(jié)牙萌出的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 顱骨鎖骨發(fā)育不全 牙囊 基質(zhì)金屬蛋白酶 miRNAs 破骨細(xì)胞

【摘要】：顱骨鎖骨發(fā)育不全(cleidocranial dysplasia,CCD)是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病,致病機(jī)理主要是位于第6染色體p21位的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因突變,導(dǎo)致RUNX2單倍劑量不足,臨床主要表現(xiàn)為骨骼發(fā)育不良和牙齒遲萌、阻生等。研究表明,CCD患者RUNX2單倍劑量不足可能會(huì)導(dǎo)致牙囊介導(dǎo)的成骨—破骨調(diào)節(jié)平衡紊亂。RUNX2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)micro RNA-31(mi R-31)的表達(dá),而mi R-31的下游調(diào)節(jié)因子SATB2與RUNX2存在調(diào)節(jié)關(guān)系,因此,存在RUNX2-mi R-31-SATB2間的生理性調(diào)節(jié)環(huán)路,但是否參與牙囊細(xì)胞調(diào)節(jié)的牙萌出機(jī)制尚不清楚。本研究在分析CCD患者牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上,旨在探討牙囊細(xì)胞RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路對(duì)于破骨活性的調(diào)控及其對(duì)牙萌出的影響。第一部分:顱骨鎖骨發(fā)育不全患者牙囊細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性目的:體外分離并培養(yǎng)CCD患者及正常同齡對(duì)照組的牙囊細(xì)胞(dental follicle cells,DFCs),并對(duì)DFCs的生物學(xué)特性進(jìn)行比較分析。方法:利用牙囊組織塊貼壁法體外提取并培養(yǎng)DFCs,待細(xì)胞自組織塊中爬出,形成集落并且當(dāng)各集落相互接觸時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng);通過(guò)細(xì)胞免疫熒光鑒定DFCs;采用用結(jié)晶紫染液染色培養(yǎng)12 d的兩種DFCs,分析其克隆形成能力;MTT法與Brd U細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析CCD患者及正常同齡對(duì)照DFCs的增殖能力;并用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)兩種DFCs成骨分化,Western blot和茜素紅染色法分析成骨能力;實(shí)時(shí)定量PCR分析破骨激活因子基因表達(dá)。結(jié)果:(1)CCD患者的DFCs(DFCs-CCD)與正常DFCs(DFCs)無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)差異,兩者的Vimentin均為陽(yáng)性表達(dá),上皮標(biāo)記物Cytokeratin均陰性表達(dá)。(2)DFCs-CCD的克隆集落多于DFCs,MTT實(shí)驗(yàn)中,同一時(shí)間點(diǎn)DFCs-CCD的吸光度值高于DFCs,DFCs-CCD的Brd U陽(yáng)性率高于DFCs。(3)與正常DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、Osterix、骨鈣素(osteocalcin,Ocn)等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平低,且形成鈣化結(jié)節(jié)少。(4)DFCs-CCD高表達(dá)核因子-κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)等破骨抑制相關(guān)因子(P0.05),而RANK配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:與DFCs相比,DFCs-CCD具有更強(qiáng)的增殖、克隆形成能力,但成骨分化能力較弱,破骨活性抑制因子高表達(dá)。第二部分:RUNX2-mi R-31-SATB2調(diào)控牙囊細(xì)胞參與牙萌出的機(jī)制目的:分析RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路對(duì)牙囊細(xì)胞侵襲、破骨細(xì)胞激活功能的影響,探討該環(huán)路參與牙囊細(xì)胞調(diào)控牙萌出的機(jī)制。方法:(1)Western blot、Real-time PCR檢測(cè)RUNX2、SATB2、mi R-31在DFCs、DFCs-CCD中的表達(dá)差異。(2)Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)比較侵襲能力,并用Western blot及明膠酶譜檢測(cè)其MMP9、MMP2表達(dá)。(3)Real-time PCR檢測(cè)破骨激活因子表達(dá),并通過(guò)牙囊細(xì)胞-骨髓細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨,檢測(cè)其誘導(dǎo)破骨能力差異。(4)通過(guò)敲減DFCs-CCD的mi R-31表達(dá),檢測(cè)其RUNX2、SATB2表達(dá)變化及誘導(dǎo)破骨能力的改變;通過(guò)過(guò)表達(dá)DFCs的mi R-31,反向驗(yàn)證RUNX2、SATB2及誘導(dǎo)破骨能力的改變。結(jié)果:(1)與DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、SATB2低表達(dá),而mi R-31高表達(dá)。(2)DFCs-CCD穿膜侵襲能力較弱,且MMP9、MMP2表達(dá)及活性較低。(3)DFCs-CCD的破骨激活因子表達(dá)、誘導(dǎo)破骨能力均較正常DFCs低。(4)DFCs-CCD敲減mi R-31,可以逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果;相反,DFCs過(guò)表達(dá)mi R-31,獲得與DFCs-CCD相似的結(jié)果。結(jié)論:CCD患者RUNX2基因突變導(dǎo)致其表達(dá)下降,進(jìn)而導(dǎo)致mi R-31表達(dá)升高及其靶基因SATB2表達(dá)下調(diào),RUNX2-mi R-31-SATB2可能參與CCD患者恒牙遲萌,操縱RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路有可能促進(jìn)牙萌出。第三部分:RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路參與牙萌出的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究目的:通過(guò)新生小鼠體內(nèi)干擾RUNX2表達(dá),探討RUNX2-mi R-31-SATB2對(duì)牙萌出的影響。方法:對(duì)出生當(dāng)日的C57BL/6J小鼠注射體內(nèi)RUNX2干擾試劑,對(duì)實(shí)驗(yàn)第8天的小鼠下頜骨標(biāo)本行免疫熒光檢測(cè)RUNX2表達(dá);TRAP染色檢測(cè)牙囊周圍活性破骨細(xì)胞;并提取牙囊組織的蛋白及RNA,分別檢測(cè)RUNX2、SATB2蛋白及mi R-31表達(dá)。對(duì)實(shí)驗(yàn)第14天的小鼠行micro CT檢測(cè),觀察其牙齒萌出情況。結(jié)果:(1)體內(nèi)干擾RUNX2第8天后,牙囊組織中RUNX2及SATB2表達(dá)均低于對(duì)照組,而mi R-31表達(dá)升高。(2)實(shí)驗(yàn)組牙囊周圍牙槽骨中的破骨細(xì)胞明顯少于對(duì)照組。(3)體內(nèi)干擾RUNX2第14天后,micro CT結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組牙齒萌出延遲。結(jié)論:體內(nèi)RUNX2干擾法可以模擬CCD患者的牙萌出,RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路可能是牙囊細(xì)胞調(diào)節(jié)牙萌出的重要生物學(xué)機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：顱骨鎖骨發(fā)育不全 牙囊 基質(zhì)金屬蛋白酶 miRNAs 破骨細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R780.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 顱骨鎖骨發(fā)育不全患者牙囊細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性15-34
• 1．材料與方法15-27
• 2. 結(jié)果27-33
• 3. 討論33-34
• 第二部分 RUNX2-mi R31SATB2調(diào)控牙囊細(xì)胞參與牙萌出的機(jī)制34-53
• 1. 材料與方法34-42
• 2. 結(jié)果42-51
• 3. 討論51-53
• 第三部分 RUNX2-mi R31SATB2環(huán)路參與牙萌出的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究53-61
• 1. 材料與方法53-56
• 2. 結(jié)果56-60
• 3. 討論60-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 綜述65-73
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況73-74
• 致謝74

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 金作林,林珠;集落刺激因子在人牙囊細(xì)胞中的表達(dá)[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2002年02期

2 谷海晶,凌均h，

本文編號(hào)：857883