本文關鍵詞：牙囊細胞通過RUNX2-MiR-31-SATB2環(huán)路調(diào)節(jié)牙萌出的機制研究

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【摘要】：顱骨鎖骨發(fā)育不全(cleidocranial dysplasia,CCD)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病,致病機理主要是位于第6染色體p21位的Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因突變,導致RUNX2單倍劑量不足,臨床主要表現(xiàn)為骨骼發(fā)育不良和牙齒遲萌、阻生等。研究表明,CCD患者RUNX2單倍劑量不足可能會導致牙囊介導的成骨—破骨調(diào)節(jié)平衡紊亂。RUNX2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)節(jié)micro RNA-31(mi R-31)的表達,而mi R-31的下游調(diào)節(jié)因子SATB2與RUNX2存在調(diào)節(jié)關系,因此,存在RUNX2-mi R-31-SATB2間的生理性調(diào)節(jié)環(huán)路,但是否參與牙囊細胞調(diào)節(jié)的牙萌出機制尚不清楚。本研究在分析CCD患者牙囊細胞生物學特性的基礎上,旨在探討牙囊細胞RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路對于破骨活性的調(diào)控及其對牙萌出的影響。第一部分:顱骨鎖骨發(fā)育不全患者牙囊細胞的體外分離培養(yǎng)及生物學特性目的:體外分離并培養(yǎng)CCD患者及正常同齡對照組的牙囊細胞(dental follicle cells,DFCs),并對DFCs的生物學特性進行比較分析。方法:利用牙囊組織塊貼壁法體外提取并培養(yǎng)DFCs,待細胞自組織塊中爬出,形成集落并且當各集落相互接觸時進行傳代培養(yǎng);通過細胞免疫熒光鑒定DFCs;采用用結(jié)晶紫染液染色培養(yǎng)12 d的兩種DFCs,分析其克隆形成能力;MTT法與Brd U細胞增殖實驗分析CCD患者及正常同齡對照DFCs的增殖能力;并用成骨誘導液誘導兩種DFCs成骨分化,Western blot和茜素紅染色法分析成骨能力;實時定量PCR分析破骨激活因子基因表達。結(jié)果:(1)CCD患者的DFCs(DFCs-CCD)與正常DFCs(DFCs)無明顯的形態(tài)學差異,兩者的Vimentin均為陽性表達,上皮標記物Cytokeratin均陰性表達。(2)DFCs-CCD的克隆集落多于DFCs,MTT實驗中,同一時間點DFCs-CCD的吸光度值高于DFCs,DFCs-CCD的Brd U陽性率高于DFCs。(3)與正常DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、Osterix、骨鈣素(osteocalcin,Ocn)等成骨相關蛋白表達水平低,且形成鈣化結(jié)節(jié)少。(4)DFCs-CCD高表達核因子-κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)等破骨抑制相關因子(P0.05),而RANK配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)水平無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:與DFCs相比,DFCs-CCD具有更強的增殖、克隆形成能力,但成骨分化能力較弱,破骨活性抑制因子高表達。第二部分:RUNX2-mi R-31-SATB2調(diào)控牙囊細胞參與牙萌出的機制目的:分析RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路對牙囊細胞侵襲、破骨細胞激活功能的影響,探討該環(huán)路參與牙囊細胞調(diào)控牙萌出的機制。方法:(1)Western blot、Real-time PCR檢測RUNX2、SATB2、mi R-31在DFCs、DFCs-CCD中的表達差異。(2)Transwell穿膜實驗比較侵襲能力,并用Western blot及明膠酶譜檢測其MMP9、MMP2表達。(3)Real-time PCR檢測破骨激活因子表達,并通過牙囊細胞-骨髓細胞共培養(yǎng)誘導破骨,檢測其誘導破骨能力差異。(4)通過敲減DFCs-CCD的mi R-31表達,檢測其RUNX2、SATB2表達變化及誘導破骨能力的改變;通過過表達DFCs的mi R-31,反向驗證RUNX2、SATB2及誘導破骨能力的改變。結(jié)果:(1)與DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、SATB2低表達,而mi R-31高表達。(2)DFCs-CCD穿膜侵襲能力較弱,且MMP9、MMP2表達及活性較低。(3)DFCs-CCD的破骨激活因子表達、誘導破骨能力均較正常DFCs低。(4)DFCs-CCD敲減mi R-31,可以逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果;相反,DFCs過表達mi R-31,獲得與DFCs-CCD相似的結(jié)果。結(jié)論:CCD患者RUNX2基因突變導致其表達下降,進而導致mi R-31表達升高及其靶基因SATB2表達下調(diào),RUNX2-mi R-31-SATB2可能參與CCD患者恒牙遲萌,操縱RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路有可能促進牙萌出。第三部分:RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路參與牙萌出的動物實驗研究目的:通過新生小鼠體內(nèi)干擾RUNX2表達,探討RUNX2-mi R-31-SATB2對牙萌出的影響。方法:對出生當日的C57BL/6J小鼠注射體內(nèi)RUNX2干擾試劑,對實驗第8天的小鼠下頜骨標本行免疫熒光檢測RUNX2表達;TRAP染色檢測牙囊周圍活性破骨細胞;并提取牙囊組織的蛋白及RNA,分別檢測RUNX2、SATB2蛋白及mi R-31表達。對實驗第14天的小鼠行micro CT檢測,觀察其牙齒萌出情況。結(jié)果:(1)體內(nèi)干擾RUNX2第8天后,牙囊組織中RUNX2及SATB2表達均低于對照組,而mi R-31表達升高。(2)實驗組牙囊周圍牙槽骨中的破骨細胞明顯少于對照組。(3)體內(nèi)干擾RUNX2第14天后,micro CT結(jié)果顯示實驗組牙齒萌出延遲。結(jié)論:體內(nèi)RUNX2干擾法可以模擬CCD患者的牙萌出,RUNX2-mi R-31-SATB2環(huán)路可能是牙囊細胞調(diào)節(jié)牙萌出的重要生物學機制。
【關鍵詞】：顱骨鎖骨發(fā)育不全 牙囊 基質(zhì)金屬蛋白酶 miRNAs 破骨細胞
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R780.2
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 顱骨鎖骨發(fā)育不全患者牙囊細胞的體外分離培養(yǎng)及生物學特性15-34
• 1．材料與方法15-27
• 2. 結(jié)果27-33
• 3. 討論33-34
• 第二部分 RUNX2-mi R31SATB2調(diào)控牙囊細胞參與牙萌出的機制34-53
• 1. 材料與方法34-42
• 2. 結(jié)果42-51
• 3. 討論51-53
• 第三部分 RUNX2-mi R31SATB2環(huán)路參與牙萌出的動物實驗研究53-61
• 1. 材料與方法53-56
• 2. 結(jié)果56-60
• 3. 討論60-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻62-65
• 綜述65-73
• 參考文獻69-73
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況73-74
• 致謝74

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1 金作林,林珠;集落刺激因子在人牙囊細胞中的表達[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2002年02期

2 谷海晶,凌均h，

本文編號：857883