本文關(guān)鍵詞：miR-210誘導(dǎo)犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實驗研究

  更多相關(guān)文章： miR-210 BMSCs 基因轉(zhuǎn)染 血管生成 骨形成

【摘要】：目的應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),體外檢測miR210基因誘導(dǎo)犬骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨和成血管方向分化的作用,探索目的基因雙重調(diào)控作用,為將來修復(fù)骨缺損打下基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物;構(gòu)建慢病毒載體Lenti-miR-210和Lenti-Lac Z,并分別用Lenti-Lac Z和Lenti-miR-210轉(zhuǎn)染BMSCs,并在轉(zhuǎn)染后的3~5d在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率;應(yīng)用MTT法檢測病毒對BMSCs增殖率的影響,并在目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs的第0天、第1天、第4天、第7天、第14天和第21天分別提取m RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western blot檢測關(guān)鍵性成血管和成骨因子的表達。同時目的基因轉(zhuǎn)染第21天,通過堿性磷酸酶(ALP)和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察體外骨形成的情況。檢測結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)為梭形,旋渦狀生長,流式細胞儀分析顯示,BMSCs間充質(zhì)干細胞表面抗原CD44、CD90高度表達,造血干細胞表面抗原CD34和CD45表達陰性,推斷出所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)=10時,BMSCs的轉(zhuǎn)染效率最高,且病毒對BMSCs增殖能力無顯著影響,在病毒轉(zhuǎn)染后的5d,倒置熒光顯微鏡觀察,病毒轉(zhuǎn)染效率均在90%以上,MOI=10時,病毒對細胞的增殖無顯著影響(P0.05);RT-PCR結(jié)果顯示,目的基因轉(zhuǎn)染的第4天、第7天、第14天和第21天,miR-210能夠顯著上調(diào)BMSCs關(guān)鍵性成骨和成血管因子的表達(P0.05);Western blot檢測結(jié)果顯示,蛋白表達與m RNA的表達趨勢幾乎一致。ALP和茜素紅鈣結(jié)節(jié)表達的檢測結(jié)果顯示,相較BMSCs組及Lenti-Lac Z/BMSCs組,Lenti-miR-210/BMSCs組ALP和鈣結(jié)節(jié)表達顯著提高。結(jié)論以慢病毒為載體的miR-210能夠成功轉(zhuǎn)染至BMSCs中,并在細胞中能夠高效持續(xù)的表達成骨、成血管因子。miR-210可以顯著促進BMSCs向成骨和成血管方向分化,這為將來的體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：miR-210 BMSCs 基因轉(zhuǎn)染 血管生成 骨形成
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R78
【目錄】：

• 中英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料與方法13-23
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 材料與設(shè)備13-15
• 2.1.2 部分試劑配制及儲存方法15-16
• 2.1.3 慢病毒載體構(gòu)建16
• 2.2 方法16-23
• 2.2.1 犬BMSCs體外培養(yǎng)16-17
• 2.2.2 流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物17
• 2.2.3 犬BMSCs的轉(zhuǎn)染和實驗分組17-18
• 2.2.4 MTT法檢測病毒對BMSCs增殖率的影響18
• 2.2.5 鈣結(jié)節(jié)的表達檢測18
• 2.2.6 行堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 染色18-19
• 2.2.7 Matrigel膠成血管實驗19
• 2.2.8 RT-PCR測定成骨和成血管相關(guān)基因的mRNA的表達19-21
• 2.2.9 Western blot檢測成血管和成骨相關(guān)蛋白的表達21-23
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理23
• 3 結(jié)果23-30
• 3.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察23
• 3.2 細胞轉(zhuǎn)染效率檢測23-24
• 3.3 病毒對BMSCs增值的影響24-25
• 3.4 流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物25-26
• 3.5 ALP和茜素紅鈣結(jié)節(jié)表達的檢測26-27
• 3.6 miR-210促進的Matrigel膠成管實驗結(jié)果27-28
• 3.7 miR-210介導(dǎo)的BMSCs成血管及成骨相關(guān)因子mRNA的表達28-29
• 3.8 miR-210介導(dǎo)的BMSCs成血管和成骨因子相關(guān)蛋白的表達29-30
• 4 討論30-33
• 5 結(jié)論33-34
• 6 參考文獻34-38
• 附錄38
• 致謝38-40
• 綜述40-48
• 參考文獻45-48

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本文編號：851658