發(fā)布時間：2017-09-13 01:08

  本文關(guān)鍵詞：腫瘤壞死因子alpha對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化、分化、凋亡等的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究

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【摘要】：牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的類似于骨組織樣的薄層礦化組織。一方面,牙骨質(zhì)包繞于牙本質(zhì)表面,使得牙髓組織免受外界刺激的干擾；另一方面,牙周膜纖維借助對牙骨質(zhì)的附著從而將牙齒固定于牙槽窩內(nèi),故完整的牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的維持是牙齒穩(wěn)定和牙髓組織健康的關(guān)鍵因素之一。正畸誘導(dǎo)性炎癥性牙根吸收(OIIRR)是正畸治療過程中十分常見的臨床問題,主要以牙骨質(zhì)等牙體組織的破壞以及牙骨質(zhì)修復(fù)不足為特征,嚴(yán)重者可導(dǎo)致牙齒的松動度增加甚至脫落。值得注意的是,除了正畸過程外,牙骨質(zhì)破壞的現(xiàn)象也常見于牙周炎患者。更為有趣的是,根據(jù)以往文獻(xiàn)報道在正畸矯治力作用和牙周炎條件下均存在牙周組織中TNF-α表達(dá)水平顯著上調(diào)的現(xiàn)象�；谝陨嫌腥さ呐R床現(xiàn)象和文獻(xiàn)依據(jù)我們提出TNF-α可能是正畸矯治力和牙周炎條件下引發(fā)牙骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵途徑。本研究擬探討TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化、分化、凋亡、增殖等方面的影響及其內(nèi)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,以期為深入認(rèn)識正畸矯治力作用和牙周炎條件下牙骨質(zhì)代謝失衡的機理提供新的研究證據(jù)。具體研究內(nèi)容包括以下三個部分：第一部分TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化能力的影響目的：探討不同濃度TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化能力的影響。方法：將永生化的小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30以7.5X104/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,采用含50 μg/ml維生素C、10mMβ-甘油磷酸鈉的礦化誘導(dǎo)液礦化誘導(dǎo),同時給予不同濃度(0、1、10、20、30、40 ng/ml)的TNF-α處理。連續(xù)培養(yǎng)10天后進(jìn)行茜素紅染色,并通過礦化結(jié)節(jié)定量試劑氯化十六烷基氨基吡啶溶解礦化結(jié)節(jié)后于酶標(biāo)儀上562nm波長處讀數(shù),以對礦化結(jié)節(jié)形成量作半定量分析。結(jié)果：Ong/mlTNF-α處理組有大量的礦化結(jié)節(jié)形成；與Ong/mlTNF-α處理組相比所有含TNF-α處理組礦化結(jié)節(jié)形成量均減少,且隨著TNF-α濃度的升高礦化結(jié)節(jié)形成量越少。結(jié)論:TNF-α能夠明顯抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力,且濃度越高抑制作用越明顯。第二部分TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、凋亡和增殖的影響目的：研究TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、凋亡和增殖的影響方法：(1)采用含50 μ g/ml維生素C、10mMB-甘油磷酸鈉的礦化誘導(dǎo)液礦化誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30,同時給予不同濃度(0、1、10、20、30、40 ng/ml)的TNF-α處理,連續(xù)培養(yǎng)7天后進(jìn)行ALP活性檢測；(2)使用不同濃度的TNF-α (0、1、10、20、30、40ng/ml)刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30一定時間,或使用20 ng/mlTNF-α刺激OCCM-30不同時間長度(0-24小時),通過real-time PCR、 western blot的方法檢測osterix、BSP、OCN、cleaved caspase-3等的表達(dá)變化；(3)使用不同濃度的TNF-α(0、 1、10、20、30、40 ng/ml)刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-3024小時,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例的變化。結(jié)果：(1)不同濃度的TNF-α均能夠降低成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30的ALP活性,且TNF-α濃度越高,對ALP活性的抑制作用也越明顯；(2)不同濃度TNF-α均能夠降低成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30中osterix的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,且濃度越高抑制作用越明顯；20 ng/mlTNF-α在0-24小時的時間范圍內(nèi)能夠抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30中osterix的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,且隨著時間的延長抑制作用越明顯；不同濃度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小時后均能夠降低成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30中BSP、OCN的mRNA表達(dá)水平,且濃度越高抑制作用越明顯；(3)不同濃度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小時后均能夠顯著上調(diào)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30中cleaved caspase-3的表達(dá)水平,且濃度越高上調(diào)作用越明顯；20 ng/mlTNF-α在0-24小時的時間范圍內(nèi)能夠顯著上調(diào)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30中cleaved caspase-3的表達(dá)水平,且隨著時間的延長上調(diào)作用越明顯；(4)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明不同濃度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小時后均能夠顯著上調(diào)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30的凋亡細(xì)胞比例,且濃度越高上調(diào)作用越明顯。結(jié)論：TNF-α能夠抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化、促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的凋亡,且均表現(xiàn)出嚴(yán)格的濃度和時間依賴性。第三部分TNF-α調(diào)控成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究目的：探討p53、PP2Ac、Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt以及NF-κB等信號通路在TNF-α調(diào)控成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和凋亡過程中的作用。方法：(1)使用TNF-α刺激體外培養(yǎng)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞系OCCM-30,利用real-time PCR, western blot檢測p53、MDM2、p21、PP2Ac alpha、PP2Ac beta, p-Erk1/2、 Erk1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-Akt、Akt、p-p65、p65等的表達(dá)變化；(2)采用p53特異性化學(xué)阻斷劑PFT-α、P53 siRNA或PP2Ac特異性化學(xué)阻斷劑OA預(yù)處理細(xì)胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞24小時后通過real-time PCR, western blot的方法檢測osterix、cleaved caspase-3等的表達(dá)水平；(3)采用p38通路阻斷劑SB203580、Erk1/2通路阻斷劑PD98059、JNK通路阻斷劑SP600125、PI3K-Akt通路阻斷劑LY294002、NF-κB通路阻斷劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激24小時后通過real-time PCR、western blot的方法檢測osterix、cleaved caspase-3等的表達(dá)水平；(4)采用p38、Erk1/2、 JNK、PI3K-Akt、NF-κB等信號通路阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激24小時后通過real-time PCR、western blot的方法檢測成牙骨質(zhì)細(xì)胞中p53、MDM2等的表達(dá)水平。結(jié)果：(1) TNF-α能夠增強p53、MDM2、p21、PP2Ac alpha、PP2Ac beta等的表達(dá)水平：TNF-α能夠顯著增強p-Erk1/2、p-p38、p-JNK、p-Akt、p-p65的表達(dá)而Erk1/2、p38、JNK、Akt、p65的表達(dá)則無明顯變化；(2)使用p53阻斷劑PFT-α或p53 siRNA預(yù)處理細(xì)胞后,與單純TNF-α處理組相比,osterix的表達(dá)水平上升而cleaved caspase-3的表達(dá)水平下降；使用PP2Ac阻斷劑OA預(yù)處理細(xì)胞后,與單純TNF-α處理組相比,osterix的表達(dá)水平無明顯變化而cleaved caspase-3的表達(dá)呈現(xiàn)無規(guī)律波動；(3)采用p38、Erk1/2、JNK、PI3K-Akt、NF-κB等信號通路阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞后,與單純TNF-α處理組相比,osterix的表達(dá)水平被更為強烈地抑制而cleaved caspase-3則被更為強烈地上調(diào)；(4)采用p38、Erk1/2、JNK、PI3K-Akt等信號通路阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞后,p53和MDM2的表達(dá)水平較單純TNF-α刺激時有了進(jìn)一步的上升；與以上阻斷劑處理組相反,采用NF-κB阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞后p53和MDM2的表達(dá)水平較單純TNF-α刺激時下降。結(jié)論：(1)在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中p53、PP2Ac、Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt以及NF-κB等信號通路均能夠被TNF-α激活；(2)p53能夠介導(dǎo)TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化抑制和凋亡誘導(dǎo)作用；(3)與p53的作用相反,Erk1/2、p38、JNK、 PI3K-Akt以及NF-κB等信號通路在被TNF-α激活后負(fù)反饋調(diào)控TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化抑制和凋亡誘導(dǎo)作用；(4) Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt信號通路依賴或至少部分依賴它們對p53的調(diào)控作用來實現(xiàn)對TNF-α抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、促進(jìn)凋亡過程的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用；然而NF-κB信號通路并不依賴p53來實現(xiàn)其對TNF-α抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、促進(jìn)凋亡過程的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：正畸誘導(dǎo)性炎癥性牙根吸收 腫瘤壞死因子alpha 成牙骨質(zhì)細(xì)胞 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點6-7
• 英文縮略詞表7-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 引言19-21
• 綜述21-29
• 正文29-87
• 第一部分 TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化能力的影響30-38
• 1 材料和方法31-35
• 2 實驗結(jié)果35-36
• 3 討論36-37
• 4 總結(jié)37-38
• 第二部分 TNF-α對成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、凋亡和增殖等的影響38-60
• 1 材料和方法40-54
• 2 實驗結(jié)果54-55
• 3 討論55-59
• 4 總結(jié)59-60
• 第三部分 TNF-α調(diào)控成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究60-77
• 1 材料和方法62-65
• 2 實驗結(jié)果65-75
• 3 討論75-76
• 4 結(jié)論76-77
• 附圖77-87
• 參考文獻(xiàn)87-107
• 個人簡歷107-108
• 致謝108-110

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本文編號：840613