本文關(guān)鍵詞：Semaphorin 3A的促成骨分化作用在2型糖尿病大鼠種植體骨結(jié)合中的應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 2型糖尿病 骨結(jié)合 脂肪干細胞 Semaphorins 3A

【摘要】：種植義齒是目前最為理想的口腔缺牙修復(fù)方式,但由于骨結(jié)合不良,T2DM患者種植義齒的失敗率顯著高于健康缺牙患者。有研究表明T2DM種植體周圍成骨相關(guān)細胞的成骨分化能力受到抑制是骨結(jié)合不足的關(guān)鍵因素,因此,提高成骨相關(guān)細胞的成骨分化能力是解決T2DM骨結(jié)合不良的根本途徑。Sema3A是新發(fā)現(xiàn)的極具特色的骨保護因子,能夠同時有效的促進成骨分化和抑制破骨分化,可能是較為理想的提高種植體骨結(jié)合的分子。因此,本研究首先采用了殼聚糖薄膜作為載體將Sema3A負(fù)載到鈦種植體表面,體外觀察了其促進成骨分化的效應(yīng)。近些年來,由于ASCs具有來源廣泛、取材方便、傷害性小等優(yōu)勢,是極為理想的干細胞來源,而基于ASCs的膜片技術(shù)被認(rèn)為是極富前景的組織修復(fù)技術(shù),目前尚未見應(yīng)用于種植體周圍的報道。與此同時,對于ASCs成骨分化能力目前尚存在諸多爭議,多數(shù)認(rèn)為ASCs的骨基質(zhì)礦化作用和鈣沉積尚不能滿足T2DM患者種植修復(fù)的臨床需求,因此有必要提高ASCs的成骨能力以應(yīng)用于種植體周圍。因此,本研究隨后擬采用Sema3A修飾ASCs,檢測Sema3A對于ASCs形態(tài)、增殖及成骨能力的影響,并通過動物體內(nèi)實驗證實Sema3A修飾的ASCs膜片包裹到種植體周圍對T2DM大鼠種植體骨結(jié)合的作用。第一部分Sema3A修飾的種植體表面對成骨細胞成骨分化的促進作用目的:觀察Sema3A修飾的種植體表面對成骨細胞行為的影響。方法:鈦種植體采用MAO處理,利用硅烷偶聯(lián)劑將殼聚糖和Sema3A混合物共價結(jié)合到MAO鈦種植體表面,根據(jù)種植體表面加載復(fù)合物的不同分為四組:CS/sema-MAO、CS/BSA-MAO、CS-MAO和MAO。將成骨細胞MG63直接接種到不同試樣表面,培養(yǎng)2小時后采用DAPI染色觀察細胞粘附數(shù)量;培養(yǎng)1、3、7天后采用MTT檢測細胞活力;成骨誘導(dǎo)3、7天后采用RT-q PCR檢測成骨相關(guān)基因RUNX2、ALP、OCN、BMP的表達;成骨誘導(dǎo)21天后采用茜素紅檢測礦化形成。結(jié)果:經(jīng)Sema3A修飾后的MAO種植體對成骨細胞粘附能力與對照組無顯著差別;在各個培養(yǎng)時間點對細胞活力無明顯影響;誘導(dǎo)3天后RUNX2表達提升3倍以上,其余基因表達提升了2倍以上,誘導(dǎo)7天后RUNX2無顯著提升,但其余基因表達提升到3倍以上;茜素紅染色顯示Sema3A修飾后的種植體能夠顯著促進成骨細胞礦化能力。結(jié)論:Sema3A修飾的種植體表面能夠顯著提升成骨細胞的成骨分化能力。第二部分Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響目的:觀察Sema3A對ASCs形態(tài)、增殖及成骨分化的影響。方法:調(diào)整Sema3A在培養(yǎng)液中的終濃度為0、0.25、0.5、1.0μg/ml,對應(yīng)實驗的4個組:ASC組;ASC-0.25組;ASC-0.5組;ASC-1.0組。采用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化;CCK-8法檢測細胞增殖活性;RT-q PCR技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因表達的影響;ALP染色、天狼星紅染色、茜素紅染色觀察ALP活性、膠原分泌和礦化程度。結(jié)果:(1)Sema3A對于ASCs形態(tài)變化無明顯影響。(2)Sema3A劑量的改變未對ASCs增殖能力產(chǎn)生影響。(3)隨著Sema3A濃度的增加,成骨分化相關(guān)基因ALP、COL1等表達明顯升高。(4)隨著Sema3A濃度的增加,ALP表達和膠原分泌增加;茜素紅染色可見Sema3A干預(yù)組鈣結(jié)節(jié)生成較空白ASCs組增加,但各個濃度之間差異不明顯。結(jié)論:Sema3A對于ASCs形態(tài)變化、增殖能力均影響不大,但能夠顯著增強ASCs的成骨分化能力,且Sema3A濃度的增加,促進作用也增強。第三部分Sema3A修飾的ASCs膜片對T2DM大鼠種植體骨結(jié)合的作用目的:觀察Sema3A修飾后的ASCs膜片對于T2DM種植體骨結(jié)合的影響。方法:高脂高糖飼料喂養(yǎng)+小劑量STZ腹腔注射誘導(dǎo)T2DM大鼠,采用含不同濃度Sema3A(0、0.25、0.5、1.0μg/ml)的成膜誘導(dǎo)液培養(yǎng)誘導(dǎo)ASCs形成膜片并包裹種植體形成膜片-種植體復(fù)合物,將膜片-種植體復(fù)合物植入T2DM大鼠脛骨近骺端,4周、8周后取材分別行Micro-CT掃描及Van Gieson染色分析。結(jié)果:誘導(dǎo)成功的T2DM大鼠隨機血糖較穩(wěn)定,且均16.7 mmol/l;倒置光學(xué)顯微鏡下可見膜片誘導(dǎo)成功,刮取后回縮成球形,能很好的包裹種植體;Micro-CT掃描結(jié)果可見,隨Sema3A濃度的增加,種植體周圍新骨形成增加;組織染色可見Sema3A修飾的ASCs膜片組種植體周圍可見較厚且連續(xù)的新骨生成。結(jié)論:Sema3A修飾的ASCs膜片能夠促進T2DM種植體骨結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：2型糖尿病 骨結(jié)合 脂肪干細胞 Semaphorins 3A
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R783
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-27
• 第一部分Sema3A修飾的種植體表面對成骨細胞成骨分化的促進作用27-35
• 1 實驗材料27-28
• 1.1 主要實驗試劑與材料27-28
• 1.2 主要實驗儀器28
• 2 實驗方法28-30
• 2.1 實驗分組28-29
• 2.2 Sema3A涂層制備29
• 2.3 細胞粘附觀察29
• 2.4 細胞活力檢測29
• 2.5 成骨相關(guān)基因檢測29-30
• 2.6 茜素紅染色30
• 2.7 統(tǒng)計分析30
• 3 結(jié)果30-33
• 3.1 細胞粘附30-31
• 3.2 細胞活力檢測31-32
• 3.3 成骨相關(guān)基因表達32-33
• 3.4 礦化染色33
• 4 討論33-35
• 第二部分Sema3A對于ASCS形態(tài)、增殖及成骨能力影響的研究35-45
• 1 實驗材料35-36
• 1.1 主要實驗試劑與材料35-36
• 1.2 主要實驗儀器36
• 1.3 實驗動物36
• 2 實驗方法36-38
• 2.1 實驗分組36
• 2.2 大鼠ASCs的分離培養(yǎng)36-37
• 2.3 含不同濃度Sema3A的培養(yǎng)液對于大鼠ASCs形態(tài)變化的影響37
• 2.4 含不同濃度Sema3A的培養(yǎng)液對于大鼠ASCs增殖能力的影響37
• 2.5 不同濃度Sema3A的對于大鼠ASCs成骨基因表達情況的影響37-38
• 2.6 不同濃度Sema3A對于ASCs成骨染色的影響38
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析38
• 3 實驗結(jié)果38-43
• 3.1 ASCs形態(tài)觀察38-39
• 3.2 不同濃度Sema3A對于ASCs形態(tài)變化的影響39
• 3.3 不同濃度Sema3A對于ASCs增殖能力的影響39-40
• 3.4 不同濃度Sema3A對于大鼠ASCs成骨基因表達情況的影響40-41
• 3.5 不同濃度Sema3A對于大鼠ASCs成骨染色的影響41-43
• 4 討論43-45
• 第三部分Sema3A修飾ASCS膜片對T2DM種植體骨結(jié)合的影響45-55
• 1 實驗材料45-47
• 1.1 主要實驗試劑與材料45-46
• 1.2 主要實驗儀器46
• 1.3 實驗動物46-47
• 2 實驗方法47-50
• 2.1 實驗分組47
• 2.2 T2DM大鼠模型的構(gòu)建47-48
• 2.3 大鼠ASCs的分離培養(yǎng)及成膜誘導(dǎo)48
• 2.4 將Sema3A修飾的ASCs膜片包裹種植體，，植入T2DM大鼠脛骨48-49
• 2.5 Micro-CT掃描49
• 2.6 組織學(xué)染色49-50
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析50
• 3 結(jié)果50-53
• 3.1 T2DM大鼠模型的構(gòu)建50-51
• 3.2 膜片、膜片種植體復(fù)合物51-52
• 3.3 Micro-CT掃描及分析52
• 3.4 組織學(xué)染色52-53
• 4 討論53-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻56-67
• 個人簡歷和研究成果67-68
• 致謝68

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