本文關(guān)鍵詞：人牙周膜干細(xì)胞成骨分化相關(guān)lncRNAs的篩選及鑒定

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【摘要】：研究背景牙齒功能及壽命與牙周組織的支持密不可分,其中牙周膜(periodontal ligament,PDL)是圍繞牙根并連結(jié)牙根和牙槽骨內(nèi)壁的致密結(jié)締組織。它具有一定的自我更新及修復(fù)的能力,但這種修復(fù)能力是有限的,在炎癥等情況下該能力會(huì)受到抑制,針對(duì)牙周炎等情況所造成的牙周組織缺損最理想的治療是獲得一定程度上的牙周再生,其中種子細(xì)胞為牙周組織再生的研究重點(diǎn)。人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)被認(rèn)為是牙周組織再生工程的關(guān)鍵細(xì)胞之一,具有多向分化以及自我更新潛能,是牙周組織再生最豐富、最直接的種子細(xì)胞,也是牙周缺損修復(fù)和基因治療重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt(核苷酸單位)的功能性RNA分子,不編碼蛋白質(zhì),但可調(diào)控基因表達(dá)。lncRNA作用范圍廣泛,可在染色質(zhì)水平、表達(dá)水平和翻譯水平發(fā)揮調(diào)控作用,參與生命體的胚胎發(fā)育、組織分化和器官形成等生命活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在多種復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可發(fā)生特異性表達(dá),且在干細(xì)胞的干性維持及多向分化中也發(fā)揮著重要作用。然而,目前在hPDLSCs成骨分化過(guò)程中有關(guān)lncRNA的研究尚鮮有報(bào)道。本研究旨在探索lncRNA對(duì)hPDLSCs成骨分化的作用,為將來(lái)牙周組織缺損修復(fù)和牙周組織再生工程提供新的思路。本論文主要包括以下四章內(nèi)容：第一章人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定本章實(shí)驗(yàn)采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離純化hPDLSCs,CCK8法檢測(cè)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記物,采用單克隆形成實(shí)驗(yàn)和多向誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力及多向分化潛能。第二章基因芯片檢測(cè)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化相關(guān)lncRNA汲其驗(yàn)證采用基因芯片技術(shù)對(duì)成骨誘導(dǎo)14 d及對(duì)照組hPDLSCs的RNA提取物進(jìn)行檢測(cè),分析成骨誘導(dǎo)前后hPDLSCs中mRN A及ncRN A的表達(dá)水平變化情況,利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)對(duì)基因芯片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。第三章人牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前后lncRNA-mRNA虻共表達(dá)譜的構(gòu)建及關(guān)鍵IncRNA的篩選利用基因本體論(gene ontology,GO)、路徑分析(pathway analysis)等生物信息學(xué)方法對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行初步的分析,采用編碼.非編碼.基因共表達(dá)(coding-noncoding gene co-expression,CNC)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)構(gòu)建lncRNA與mRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜,根據(jù)分析結(jié)果篩選出在hPDLSCs成骨分化過(guò)程中的關(guān)鍵In cRNA;qRT-PC濫測(cè)關(guān)鍵lncRNA在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)前后及牙周膜組織中的表達(dá)水平。第四章抑制TCONS_00007046表達(dá)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響構(gòu)建lncRNA TCONS_00007046 shRNA'陵病毒并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,利用qRT-PCR檢測(cè)慢病毒抑制效率,CCK8法檢測(cè)抑锘TCONS_00007046表達(dá)對(duì)hPDLSCs增殖能力的影響。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性染色及茜素紅S染色檢測(cè)成骨誘導(dǎo)14 d后檢測(cè)抑制T℃ONS 00007046表達(dá)對(duì)hPDLSCs成骨分化的影響,并利用qRT-PC法檢測(cè)成骨相關(guān)基因(ALP.OCN.Runx2. BMP2及BMP6)表達(dá)水平變化。材料方法組織獲取及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用離體牙取自南方醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25歲患者因阻生需要拔除的健康、完整的第三磨牙(經(jīng)患者知情同意)。所選患者無(wú)其他系統(tǒng)性疾病史、吸煙或特殊用藥史。牙齒拔除后迅速置于含雙抗的a-MEM培養(yǎng)液中,放入冰盒內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)內(nèi)輕輕刮取牙根中1/3的牙周膜組織,PBS緩沖液中反復(fù)漂洗。用眼科剪將組織小心地剪碎成1mm×11 mm×1 mm大小,置于3mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL的中性蛋白酶混合液中,37℃水浴消化30min。加入適量完全培養(yǎng)基終止消化,800 rpm離心3 min,小心棄去上清,并加入少量完全培養(yǎng)基,用槍頭輕輕吹打均勻,使細(xì)胞懸液與松散組織呈混勻狀態(tài),接種至6孔板內(nèi)鋪平,加蓋玻片于組織塊之上并加入適量含有10%胎牛血清、100μmol/L磷酸鹽抗壞血酸、2 mmol/L谷氨酸鹽、100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)液,于5%C02、37℃環(huán)境中培養(yǎng),每2～3d換液。取第1代人牙周膜細(xì)胞,胰酶消化制成細(xì)胞懸液,并利用逐步稀釋法將細(xì)胞濃度調(diào)整為10～15個(gè)/mL。按100 μL/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板中,5%C02、37℃環(huán)境培養(yǎng)12 h后,在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,標(biāo)記出僅含單個(gè)細(xì)胞的孔并加培養(yǎng)液至20 μL,每2～3d換液,當(dāng)單細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至70～80%時(shí)消化傳代。CCK8實(shí)驗(yàn)取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hPDLSCs,以2×103個(gè)/孔的密度(約100μL/孔細(xì)胞懸液)接種于96孔板中,5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后,向每孔內(nèi)加入10μL CCK8溶液,“十”字法混勻后避光培養(yǎng)1～4 h,然后用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下各孔的OD值,并取平均值繪制生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記物取第3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLSCs,以1×106個(gè)/mL的密度重懸于預(yù)冷的PBS緩沖液中。以小鼠抗人PE標(biāo)記的C D146、CD2、CD31、CD34、CD90抗體及APC標(biāo)記Stro-1抗體,冰上避光孵育1 h。預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2～3次后,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面分子標(biāo)記物�？寺⌒纬陕蕶z測(cè)取第3代細(xì)胞,以1×102個(gè)/$1的密度接種于100 mm直徑的培養(yǎng)皿中。置于5%C02、37℃環(huán)境培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14d后,棄去原培養(yǎng)液,PBS緩沖液清洗后,用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞,結(jié)晶紫染色劑染色,倒置顯微鏡下觀察單克隆形成情況(以≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆),并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。多向分化能力檢測(cè)取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí),棄去原培養(yǎng)液,并分別加入成骨、成脂誘導(dǎo)液,每3d換液。連續(xù)培養(yǎng)21d后,分別用2%茜素紅S、油紅O染色劑染色,顯微鏡下觀察。RNA是取與基因芯片檢測(cè)對(duì)第3代hPDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng),分別提取培養(yǎng)14 d后兩組細(xì)胞的總RNA,Trizo1法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。 NanoDropND-1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度與純度,分別進(jìn)行l(wèi)ncRNA和mRNA表達(dá)譜基因microarray芯片檢測(cè),每組檢測(cè)重復(fù)分別3次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)其純度和濃度,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,SYBR Greei法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以GADPH作為內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。生物信息學(xué)分析利用基因芯片結(jié)果,綜合數(shù)據(jù)庫(kù)資源,利用聚類分析、GO分析、pathway分析等生物信息學(xué)方法,對(duì)基因芯片的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步的分析,以P值大小作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),P0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。編碼-非編碼基因共表達(dá)分析根據(jù)lncRNA和mRN A的差異表達(dá)譜,通過(guò)計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearsonproduct-moment correlation coefficient,r)判斷基因之間存在的相關(guān)性,并根據(jù)結(jié)果構(gòu)建lncRNA與目標(biāo)靶基因的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape軟件繪制共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖譜。慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞感染目的慢病毒載體為GV118-GFP,包裝細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞,由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝；陰性對(duì)照選擇與人類基因無(wú)任何關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)序列。將慢病毒以不同感染復(fù)數(shù)感染hPDLSCs,并于72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白熒光表達(dá)情況,以篩選確定最合適的感染復(fù)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較,計(jì)算Pearson目關(guān)系數(shù)(r)以判斷兩個(gè)變量之間是否共同產(chǎn)生變化的關(guān)聯(lián)程度,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.人牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)特性觀察本實(shí)驗(yàn)采用改良酶組織塊法及有限稀釋法分離獲得hPDLSCs,成骨及成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證明其有多向分化能力,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其具有克隆形成能力。流式檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物CD29(99.62%), CD90(97.13%),CD146(10.27%)和Stro-1(12.76%);陰性表達(dá)造血干細(xì)胞分子標(biāo)記物CD31(0.07%)和CD34(0.22%).2.成骨誘導(dǎo)前后lncRNA及mRN差異表達(dá)情況基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后共有994個(gè)lncRNA出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),1177個(gè)下調(diào)表達(dá)；共有3557個(gè)mRNA在成骨誘導(dǎo)后出現(xiàn)差異表達(dá),其中1578個(gè)上調(diào),1979個(gè)下調(diào)(變化倍數(shù)2.0或-2.0,P0.05)。挑選lncRNA及mRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,其結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果基本吻合。3.lncRNA-mRN譬共表達(dá)譜構(gòu)建及關(guān)鍵lncRNA的挑選GO分析結(jié)果示,出現(xiàn)差異表達(dá)的mRNA與細(xì)胞生理過(guò)程、生物調(diào)節(jié)等多個(gè)過(guò)程存在顯著相關(guān)性；Pathway分析示共有83條信號(hào)通路參與了hPDLSCs成骨分化過(guò)程,包括MAPK、VEGF、TGF-β等通路。挑選成骨相關(guān)mRNA(ALP、BMP6、 COL1A1、COL1A2、IL6、BMP5及BMP2)作為靶基因進(jìn)行CNC分析并構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)圖譜,顯示共有131對(duì)1ncRNA及mRNA之間存在負(fù)相關(guān),有262對(duì)正相關(guān)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,挑選出TCONS_00007046作為進(jìn)一步研究對(duì)象,qRT-PCR對(duì)其表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證顯示該基因在PDL組織及hPDLSCs細(xì)胞內(nèi)均存在表達(dá),且成骨誘導(dǎo)后變化趨勢(shì)與基因芯片結(jié)果具有一致性。4.抑制TCONS_00007046表達(dá)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化、增殖的影響本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建TCONS_00007046 shRNA慢病毒載體,并利用qRT-PCI凇測(cè)其抑制效率。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示抑制TCONS_00007046表達(dá)對(duì)hPDLSCs增殖不產(chǎn)生影響。ALP活性染色檢測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行14 d的成骨誘導(dǎo)后,TCONS_00007046表達(dá)抑制的hPDLSCs細(xì)胞中的ALP活性較低。茜素紅S染色結(jié)果亦顯示,TCONS_00007046表達(dá)抑制組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成量較對(duì)照組細(xì)胞少。qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,抑制TCONS_00007046表達(dá)時(shí),成骨相關(guān)mRNA ALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表達(dá)水平降低。結(jié)論(1)本實(shí)驗(yàn)利用有限稀釋法分離培養(yǎng)出人牙周膜干細(xì)胞,具有在體外克隆形成及成骨、成脂向分化的能力。(2)在人牙周膜干細(xì)胞及其成骨分化過(guò)程中均存在大量IncRNA的顯著差異表達(dá)。(3)生物信息學(xué)初步分析結(jié)果顯示,lncRNA在人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)控作用,其可能與成骨相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān),且該調(diào)控過(guò)程可能有多條信號(hào)通路的參與。(4)lncRNA TCONS_00007046對(duì)hPDLSCs的增殖不產(chǎn)生影響,抑制TCONS_00007046表達(dá)時(shí),hPDLSCs的成骨能力受到抑制,且該調(diào)控過(guò)程可能與成骨相關(guān)mRNA ALP、 OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：牙周膜 干細(xì)胞 長(zhǎng)鏈非編碼RNA 成骨 分化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-22
• 第一章 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定22-32
• 1 材料與方法22-25
• 2 結(jié)果25-30
• 3 討論30-32
• 第二章 基因芯片檢測(cè)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化相關(guān)lncRNAs及其驗(yàn)證32-50
• 1 材料與方法32-38
• 2 結(jié)果38-48
• 3 討論48-50
• 第三章 人牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前后lncRNA-mRNA共表達(dá)譜的構(gòu)建及關(guān)鍵lncRNA的篩選50-74
• 1 材料與方法50-55
• 2 結(jié)果55-71
• 3 討論71-74
• 第四章 抑制TCONS_00007046表達(dá)對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化、增殖的影響74-86
• 1 材料與方法74-78
• 2 結(jié)果78-83
• 3 討論83-86
• 全文總結(jié)86-87
• 參考文獻(xiàn)87-93
• 附錄93-94
• 成果94-96
• 致謝96-97

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8 孫楠;楊力;張振;張樺;陳宏;蔡德鴻;;晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨分化的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

9 馬雪;孟靜茹;賈敏;王寧;胡靜;周穎;羅曉星;;胰高血糖素樣肽-1類似物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響[A];第十一屆全國(guó)青年藥學(xué)工作者最新科研成果交流會(huì)論文集[C];2012年

10 林和敏;;成骨分化的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性研究[A];2013年全國(guó)激光醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)聯(lián)合會(huì)議暨2013年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)整形美容學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 龔逸明;microRNAs調(diào)控Satb2介導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 李松濤;EphB信號(hào)在軸向仿生壓應(yīng)力調(diào)控MSC成骨分化中的作用和機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 方文;純鈦表面WNT信號(hào)通路調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2014年

4 劉世宇;移植外源性MSCs持久恢復(fù)宿主MSCs功能的機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 張莉;Fgfr2~(S252W/+)小鼠骨量、骨結(jié)構(gòu)特性及BMSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 劉祥舟;機(jī)械牽伸通過(guò)Wnt5a、Wnt5b/JNK信號(hào)通路促進(jìn)大鼠肌腱干細(xì)胞成骨分化[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 宋明宇;電磁場(chǎng)對(duì)地塞米松干預(yù)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的效應(yīng)及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2015年

8 賈杰;MiR-17-5p調(diào)控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的相關(guān)研究[D];華中科技大學(xué);2015年

9 劉旭杰;材料性質(zhì)調(diào)控干細(xì)胞成骨分化及殼聚糖基骨修復(fù)材料[D];清華大學(xué);2015年

10 文采;多孔礦化水凝膠材料誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞成骨分化的研究[D];東南大學(xué);2015年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳小瑩;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)人脂肪干細(xì)胞增殖與成骨分化的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

2 秦子順;淫羊藿苷對(duì)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響[D];蘭州大學(xué);2015年

3 劉可;miR-106bE靶向調(diào)控BMP2參與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與體內(nèi)骨形成[D];蘇州大學(xué);2015年

4 付雪杰;MSCs與去分化MSCs在成骨分化過(guò)程中免疫原性上調(diào)的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 崔陽(yáng)陽(yáng);蛋白激酶C在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用研究[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2015年

6 嚴(yán)一杰;體外誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 高羽萱;直流微電場(chǎng)對(duì)種植體周骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和成骨影響的研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

8 郭中豪;甲狀旁腺激素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

9 李慧垠;高脂環(huán)境下大鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中Wnt通路相關(guān)因子的表達(dá)變化[D];山東大學(xué);2015年

10 聶曉萌;MicroRNA靶向Id1對(duì)BMSCs成骨分化的影響[D];山東大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：816669