本文關(guān)鍵詞：miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的生物學(xué)功能

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【摘要】：背景機械力誘導(dǎo)的牙槽骨改建是正畸牙移動最重要的生物學(xué)基礎(chǔ)理論之一。機械力激活細(xì)胞進(jìn)行骨改建的機制不僅是正畸領(lǐng)域的研究重點,也是口腔頜面外科、骨科等領(lǐng)域?qū)W者們關(guān)注的焦點。體內(nèi)和體外實驗以及臨床應(yīng)用都發(fā)現(xiàn)在正畸牙齒移動、牽張成骨、骨折修復(fù)等過程中,適當(dāng)?shù)臓繌埩δ艽碳す墙M織的生長與改建。在此過程中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)受到張應(yīng)力的作用,向牽張區(qū)趨化、增殖、成骨分化,是新骨形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),是維持骨骼系統(tǒng)穩(wěn)定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。微小RNA(MicroRNA, miRNA);是一類由20-24個核苷酸構(gòu)成的負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的非編碼單鏈RNA分子,普遍存在于各類生物體內(nèi)。通過microRNA來抑制mRNA翻譯已被發(fā)現(xiàn)是一個重要的調(diào)節(jié)骨形成的信號通路。已有大量研究表明,miRNA與BMSCs的成骨分化有密切的關(guān)系。然而以往對于牽張力作用下參與BMSCs成骨分化的miRNA少有系統(tǒng)而深入的研究。本課題組在前期實驗中通過高通量基因芯片檢測技術(shù)檢測了周期性牽張力刺激12小時與未受機械力刺激的大鼠BMSCs的miRNA基因表達(dá)譜,篩選出了一系列牽張力刺激前后差異表達(dá)的miRNA并對這些miRNA進(jìn)行了驗證。本實驗從中選取表達(dá)量顯著降低的miR-345-3p來進(jìn)行研究,驗證其在周期性牽張力誘導(dǎo)的大鼠BMSCs成骨分化中所發(fā)揮的生物學(xué)作用,并利用生物信息學(xué)方法對miR-345-3p作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測。目的探討并驗證miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化過程中的生物學(xué)作用,并通過生物信息學(xué)研究方法來預(yù)測其可能的靶基因。從microRNA的角度初步探索牽張力誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的機制,為正畸骨改建及牽張成骨技術(shù)提供理論依據(jù)以及為尋求牽張力條件下口腔診治的新策略提供理論和實驗依據(jù)。方法1.大鼠BMSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,倒置顯微鏡下觀察其生物學(xué)形態(tài),CCK-8法檢測其增殖能力；并對其進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo),應(yīng)用茜素紅染色、ALP染色、油紅O染色法證實其可以分化為成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原。2.觀察周期性牽張力作用下大鼠BMSCs內(nèi)ALP活性、成骨相關(guān)基因及miR-345-3p隨時間的表達(dá)情況：按加載時間將大鼠BMSCs分為4組一--Oh、3h、6h、12h,對各組施以牽張力刺激(1Hz、10%拉伸強度)。通過ALP活性檢測及RT-PCR檢測周期性牽張力作用下大鼠BMSCs ALP活性及Runx2、Osterix、miR-345-3p隨時間變化的表達(dá)情況。3.觀察miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化中的作用：采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)和抑制miR-345-3p在大鼠BMSCs中的表達(dá)水平,加載周期性牽張力(1Hz、10%拉伸強度)3h,通過RT-PCR、Western blot檢測大鼠BMSCs成骨分化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平,研究miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化中的生物學(xué)功能。4.通過靶基因預(yù)測軟件和生物信息學(xué)網(wǎng)站篩選miR-345-3p的候選靶基因。結(jié)果1.經(jīng)全骨髓貼壁法所獲得的細(xì)胞符合BMSCs的特征,流式細(xì)胞儀檢測其表面抗原分子CD44、CD90為陽性,CD34、CD45為陰性,經(jīng)體外誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞。2.大鼠BMSCs加載周期性牽張力(1Hz,10%拉伸強度)0、3、6、12小時后,隨加力時間延長,ALP活性逐漸增強且受力后即明顯升高(P0.05): Runx2 mRNA、Osterix mRNA表達(dá)逐漸升高且分別于受力3小時和6小時后升高明顯(P0.05); miR-345-3p的表達(dá)逐漸降低,于3小時達(dá)低谷(P0.01),之后逐漸升高,但仍低于對照組表達(dá)水平。3.上調(diào)miR-345-3p的表達(dá)水平可顯著降低周期性牽張力誘導(dǎo)的大鼠BMSCs的成骨分化能力,RT-PCR結(jié)果表明miR-345-3p mimic組較其對照組ALP、Runx2、 Osterix表達(dá)均減少(P0.05); Western blot結(jié)果顯示miR-345-3p mimic組較其對照組ALP及Runx2表達(dá)明顯減少。下調(diào)miR-345-3p的表達(dá)可增加大鼠BMSCs的成骨能力,RT-PCR結(jié)果表明miR-345-3p inhibitor組較其對照組ALP、Runx2、 Osterix表達(dá)均增強(P0.05); Western blot結(jié)果表明inhibitor組較其對照組ALP及Runx2表達(dá)明顯增加。4.生物信息學(xué)預(yù)測Hoxa2、IGF2、CBFB、BCL2、AXIN2、FN1等為miR-345-3p的候選靶基因。結(jié)論1.采用全骨髓貼壁法可分離得到較純的大鼠BMSCs,并且在體外經(jīng)過誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞。2.周期性牽張力刺激(1Hz,10%拉伸強度)可誘導(dǎo)大鼠BMSCs體外成骨分化；miR-345-3p對牽張力刺激敏感,在細(xì)胞水平上證明miR-345-3p參與了周期性牽張力誘導(dǎo)的大鼠BMSCs成骨分化。3.miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)的大鼠BMSCs成骨分化中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。4.本研究有利于更全面地理解正畸骨改建及牽張成骨的機制,為臨床實踐提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miR-345-3p 成骨分化 周期性牽張力 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymalstem cells BMSCs)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R783.5
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-17
• 實驗一：大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及干性鑒定17-23
• 一、材料與方法17-18
• 二、實驗方法18-21
• 三、結(jié)果與分析21-23
• 實驗二：miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠BMSC成骨分化過程中的表達(dá)變化23-32
• 一、材料與方法23-24
• 二、實驗方法24-30
• 三、結(jié)果與分析30-32
• 實驗三：miR-345-3p在周期性牽張力誘導(dǎo)大鼠BMSCs成骨分化中的功能及其靶基因預(yù)測32-40
• 一、材料與方法32-33
• 二、實驗方法33-38
• 三、結(jié)果與分析38-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 附圖表46-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 致謝60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄60-61
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表61

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本文編號：808678