本文關(guān)鍵詞：非損傷微測(cè)技術(shù)用于口腔鱗癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的實(shí)驗(yàn)探索

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【摘要】：目的：非損傷微測(cè)技術(shù)(Non-invasive micro-test technique,NMT)是一種選擇性微電極技術(shù),可以在不損傷活體樣品的情況下獲得進(jìn)出樣品的各種離子或分子的多維信息,能夠?qū)崟r(shí)選擇性測(cè)定進(jìn)出活體材料離子和小分子流速,該技術(shù)具有非損傷性、長(zhǎng)時(shí)間、多電極、高分辨率、高靈敏度、多角度測(cè)量等優(yōu)點(diǎn),可在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動(dòng)、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下,獲得其他技術(shù)難以測(cè)到的生理特征和生命活動(dòng)規(guī)律,從而在理論研究和應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的突破,對(duì)活體材料進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的測(cè)定和研究。將現(xiàn)用于植物生理學(xué)研究的非損傷微測(cè)技術(shù)用于人體細(xì)胞生理學(xué)研究。應(yīng)用非損傷微測(cè)技術(shù),在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動(dòng)、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下,實(shí)時(shí)測(cè)定進(jìn)出單個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞的離子和小分子流速,獲得腫瘤細(xì)胞凋亡時(shí)的02和Ca2+流的跨膜變化的動(dòng)態(tài)信息；應(yīng)用非損傷微測(cè)技術(shù)了解孟加拉紅在光動(dòng)力干預(yù)下與口腔鱗癌細(xì)胞相互作用時(shí)O2和Ca2+流的跨膜特征,以對(duì)孟加拉紅在口腔癌診療機(jī)制有所了解,有助于對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)估。并為探索非損傷微測(cè)技術(shù)在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)中的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。方法：1.非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察和記錄單個(gè)活的口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動(dòng)。2.MTT法檢測(cè)不同濃度的孟加拉紅對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的細(xì)胞毒性,不同濃度的孟加拉紅介導(dǎo)的光動(dòng)力干預(yù)下對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的細(xì)胞毒性；以及檢測(cè)了相同濃度相同激發(fā)光源的條件下,孟加拉紅(10μM)介導(dǎo)的光動(dòng)力干預(yù)下對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127細(xì)胞增殖的抑制作用。3.非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力干預(yù)下誘導(dǎo)的單個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡時(shí)的O2和Ca2+流速變化,以及響應(yīng)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的研究。(1)熒光探針DCFH-DA檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)的光動(dòng)力療法激發(fā)的細(xì)胞活性氧(ROS)的生成。(2)熒光探針羅丹明123檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的變化。(3)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)的光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。(4)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白的表達(dá)水平。(5)非損傷微測(cè)技術(shù)檢測(cè)孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的單個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡時(shí)的02和Ca2+跨膜流動(dòng)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果：1.非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)了單個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動(dòng),結(jié)果表明Cal27細(xì)胞中02在24小時(shí)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)均為內(nèi)流跨膜移動(dòng),分子流的移動(dòng)速率在16.26 pmole/cm2.s -23.99 pmole/cm2.s之間波動(dòng)；但Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)特征則表現(xiàn)不同,離子流方向有波動(dòng),既有向內(nèi)又有向外的跨膜移動(dòng),外流最大移動(dòng)速率為5.84 pmole/cm2.s,內(nèi)流最大移動(dòng)速率為3.22pmole/cm2.S。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示孟加拉紅能夠被口腔鱗癌細(xì)胞Ca127攝取,進(jìn)入細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；低濃度的孟加拉紅對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127沒有細(xì)胞毒性；但低濃度的孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127有顯著的細(xì)胞毒性,并且對(duì)細(xì)胞的增值有明顯的抑制作用。3.孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法導(dǎo)致口腔鱗癌細(xì)胞Ca127細(xì)胞內(nèi)釋放大量活性氧,細(xì)胞ROS水平顯著增加比未處理組高出2.46倍；細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平在RB-PDT處理后2小時(shí)顯示為最高峰,比未處理組高出2.84倍；ROS的釋放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低,24小時(shí)觀察期結(jié)束時(shí)僅為39.21%；同時(shí),誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡,凋亡持續(xù)發(fā)生,在RB-PDT處理后2小時(shí),凋亡率出現(xiàn)一個(gè)小高峰,達(dá)到18.55%：之后逐漸增加,在RB-PDT處理后24小時(shí),達(dá)到了30.57%。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C在光動(dòng)力激發(fā)后立即釋放出現(xiàn)蛋白表達(dá),Caspase-3、Caspase-9、PARP在觀察期2小時(shí)均開始出現(xiàn)蛋白高水平表達(dá)。4.非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)到孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的單個(gè)口腔鱗癌細(xì)胞Ca127凋亡時(shí)的02和Ca2+跨膜流速變化,02流在實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)的早期(實(shí)驗(yàn)觀察期的0-2小時(shí))與未處理組、純RB和PDT+NAC處理組的細(xì)胞相比較,其分子內(nèi)流移動(dòng)速率降低,2小時(shí)觀察時(shí)間點(diǎn)的02流移動(dòng)速率(6.43pmole/cm2.s)是最小值,后期O2分子內(nèi)流移動(dòng)速率加大；而Ca2+離子流無論是內(nèi)流還是外流,移動(dòng)速率都明顯高于未處理組和、純RB和PDT+NAC處理組,2小時(shí)觀察時(shí)間點(diǎn)的Ca2+離子移動(dòng)速率(9.53 pmole/cm.s)是Ca2+離子流由外流轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)流的高峰值。這一結(jié)果與上述Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)的細(xì)胞凋亡率和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)的蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所表達(dá)的凋亡時(shí)間趨勢(shì)是相一致的；2小時(shí)是一個(gè)關(guān)鍵和值得關(guān)注的觀察時(shí)間點(diǎn)。結(jié)論：1.非損傷微測(cè)技術(shù)可以用于人體細(xì)胞生理學(xué)研究,是在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動(dòng)、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下研究細(xì)胞病理生理學(xué)的一種好的方法,在對(duì)細(xì)胞生理特征和生命活動(dòng)規(guī)律的研究方面有很大的應(yīng)用前景。2.成功檢測(cè)到Ca127細(xì)胞在正常生長(zhǎng)代謝過程中O2、Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)特征,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。3.發(fā)現(xiàn)孟加拉紅在光動(dòng)力干預(yù)下誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制中：內(nèi)活性氧大量釋放、破壞線粒體細(xì)胞膜,線粒體膜電位降低,并造成細(xì)胞損傷,細(xì)胞色素C釋放,激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白均相續(xù)出現(xiàn)高表達(dá)。通過上述發(fā)現(xiàn),推測(cè)O2和Ca2+流的變化響應(yīng)了光動(dòng)力作用后通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào),可以作為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)的指標(biāo)；
【關(guān)鍵詞】：非損傷微測(cè)技術(shù) O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉紅 光動(dòng)力療法 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.8
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點(diǎn)6-7
• 縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 文獻(xiàn)綜述(一)16-23
• 文獻(xiàn)綜述(二)23-29
• 引言29-31
• 實(shí)驗(yàn)研究31-80
• 第一部分 非損傷微測(cè)技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)口腔鱗癌細(xì)胞的O_2和Ca~(2+)流的實(shí)驗(yàn)研究31-44
• 1 材料32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟33-37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-39
• 5 附圖39-44
• 第二部分 孟加拉紅介導(dǎo)光動(dòng)力療法抑制口腔鱗癌細(xì)胞增值的實(shí)驗(yàn)研究44-55
• 1 材料44-45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟45-48
• 3 結(jié)果48-49
• 4 討論49-50
• 5 附圖50-55
• 第三部分 O_2和Ca~(2+)流的變化響應(yīng)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞凋亡信號(hào)的55-80
• 1 材料56-57
• 2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟57-64
• 3 結(jié)果64-66
• 4 討論66-71
• 5 附圖71-80
• 參考文獻(xiàn)80-89
• 發(fā)表的研究相關(guān)論文89-90
• 附件90-92
• 致謝92-93

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本文編號(hào)：804165