本文關(guān)鍵詞：非損傷微測技術(shù)用于口腔鱗癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究的實驗探索

  更多相關(guān)文章： 非損傷微測技術(shù) O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉紅 光動力療法 細(xì)胞凋亡

【摘要】：目的：非損傷微測技術(shù)(Non-invasive micro-test technique,NMT)是一種選擇性微電極技術(shù),可以在不損傷活體樣品的情況下獲得進(jìn)出樣品的各種離子或分子的多維信息,能夠?qū)崟r選擇性測定進(jìn)出活體材料離子和小分子流速,該技術(shù)具有非損傷性、長時間、多電極、高分辨率、高靈敏度、多角度測量等優(yōu)點,可在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下,獲得其他技術(shù)難以測到的生理特征和生命活動規(guī)律,從而在理論研究和應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生實質(zhì)性的突破,對活體材料進(jìn)行實時、動態(tài)的測定和研究。將現(xiàn)用于植物生理學(xué)研究的非損傷微測技術(shù)用于人體細(xì)胞生理學(xué)研究。應(yīng)用非損傷微測技術(shù),在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下,實時測定進(jìn)出單個口腔鱗癌細(xì)胞的離子和小分子流速,獲得腫瘤細(xì)胞凋亡時的02和Ca2+流的跨膜變化的動態(tài)信息；應(yīng)用非損傷微測技術(shù)了解孟加拉紅在光動力干預(yù)下與口腔鱗癌細(xì)胞相互作用時O2和Ca2+流的跨膜特征,以對孟加拉紅在口腔癌診療機(jī)制有所了解,有助于對其應(yīng)用前景進(jìn)行評估。并為探索非損傷微測技術(shù)在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)中的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。方法：1.非損傷微測技術(shù)實時動態(tài)觀察和記錄單個活的口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動。2.MTT法檢測不同濃度的孟加拉紅對口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的細(xì)胞毒性,不同濃度的孟加拉紅介導(dǎo)的光動力干預(yù)下對口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的細(xì)胞毒性；以及檢測了相同濃度相同激發(fā)光源的條件下,孟加拉紅(10μM)介導(dǎo)的光動力干預(yù)下對口腔鱗癌細(xì)胞Ca127細(xì)胞增殖的抑制作用。3.非損傷微測技術(shù)實時動態(tài)檢測孟加拉紅介導(dǎo)光動力干預(yù)下誘導(dǎo)的單個口腔鱗癌細(xì)胞凋亡時的O2和Ca2+流速變化,以及響應(yīng)光動力療法誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞凋亡信號通路的研究。(1)熒光探針DCFH-DA檢測孟加拉紅介導(dǎo)的光動力療法激發(fā)的細(xì)胞活性氧(ROS)的生成。(2)熒光探針羅丹明123檢測孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的變化。(3)Annexin V-FITC/PI雙染檢測孟加拉紅介導(dǎo)的光動力療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。(4)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白的表達(dá)水平。(5)非損傷微測技術(shù)檢測孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法誘導(dǎo)的單個口腔鱗癌細(xì)胞凋亡時的02和Ca2+跨膜流動的實時動態(tài)變化。結(jié)果：1.非損傷微測技術(shù)實時動態(tài)檢測了單個口腔鱗癌細(xì)胞Ca127的O2和Ca2+的跨膜流動,結(jié)果表明Cal27細(xì)胞中02在24小時實驗觀察期內(nèi)均為內(nèi)流跨膜移動,分子流的移動速率在16.26 pmole/cm2.s -23.99 pmole/cm2.s之間波動；但Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運動力學(xué)特征則表現(xiàn)不同,離子流方向有波動,既有向內(nèi)又有向外的跨膜移動,外流最大移動速率為5.84 pmole/cm2.s,內(nèi)流最大移動速率為3.22pmole/cm2.S。2.實驗結(jié)果顯示孟加拉紅能夠被口腔鱗癌細(xì)胞Ca127攝取,進(jìn)入細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；低濃度的孟加拉紅對口腔鱗癌細(xì)胞Ca127沒有細(xì)胞毒性；但低濃度的孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法對口腔鱗癌細(xì)胞Ca127有顯著的細(xì)胞毒性,并且對細(xì)胞的增值有明顯的抑制作用。3.孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法導(dǎo)致口腔鱗癌細(xì)胞Ca127細(xì)胞內(nèi)釋放大量活性氧,細(xì)胞ROS水平顯著增加比未處理組高出2.46倍；細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平在RB-PDT處理后2小時顯示為最高峰,比未處理組高出2.84倍；ROS的釋放導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低,24小時觀察期結(jié)束時僅為39.21%；同時,誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡,凋亡持續(xù)發(fā)生,在RB-PDT處理后2小時,凋亡率出現(xiàn)一個小高峰,達(dá)到18.55%：之后逐漸增加,在RB-PDT處理后24小時,達(dá)到了30.57%。Western blotting檢測結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C在光動力激發(fā)后立即釋放出現(xiàn)蛋白表達(dá),Caspase-3、Caspase-9、PARP在觀察期2小時均開始出現(xiàn)蛋白高水平表達(dá)。4.非損傷微測技術(shù)實時動態(tài)檢測到孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法誘導(dǎo)的單個口腔鱗癌細(xì)胞Ca127凋亡時的02和Ca2+跨膜流速變化,02流在實時動態(tài)檢測的早期(實驗觀察期的0-2小時)與未處理組、純RB和PDT+NAC處理組的細(xì)胞相比較,其分子內(nèi)流移動速率降低,2小時觀察時間點的02流移動速率(6.43pmole/cm2.s)是最小值,后期O2分子內(nèi)流移動速率加大；而Ca2+離子流無論是內(nèi)流還是外流,移動速率都明顯高于未處理組和、純RB和PDT+NAC處理組,2小時觀察時間點的Ca2+離子移動速率(9.53 pmole/cm.s)是Ca2+離子流由外流轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)流的高峰值。這一結(jié)果與上述Annexin V-FITC/PI雙染檢測的細(xì)胞凋亡率和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測的蛋白表達(dá)的實驗結(jié)果所表達(dá)的凋亡時間趨勢是相一致的；2小時是一個關(guān)鍵和值得關(guān)注的觀察時間點。結(jié)論：1.非損傷微測技術(shù)可以用于人體細(xì)胞生理學(xué)研究,是在不接觸細(xì)胞、不干擾細(xì)胞活動、不影響細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)機(jī)制的條件下研究細(xì)胞病理生理學(xué)的一種好的方法,在對細(xì)胞生理特征和生命活動規(guī)律的研究方面有很大的應(yīng)用前景。2.成功檢測到Ca127細(xì)胞在正常生長代謝過程中O2、Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運動力學(xué)特征,為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。3.發(fā)現(xiàn)孟加拉紅在光動力干預(yù)下誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制中：內(nèi)活性氧大量釋放、破壞線粒體細(xì)胞膜,線粒體膜電位降低,并造成細(xì)胞損傷,細(xì)胞色素C釋放,激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白均相續(xù)出現(xiàn)高表達(dá)。通過上述發(fā)現(xiàn),推測O2和Ca2+流的變化響應(yīng)了光動力作用后通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號,可以作為檢測腫瘤細(xì)胞凋亡信號的指標(biāo)；
【關(guān)鍵詞】：非損傷微測技術(shù) O_2流 Ca~(2+)流 孟加拉紅 光動力療法 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 論文創(chuàng)新點6-7
• 縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-16
• 文獻(xiàn)綜述(一)16-23
• 文獻(xiàn)綜述(二)23-29
• 引言29-31
• 實驗研究31-80
• 第一部分 非損傷微測技術(shù)實時動態(tài)檢測口腔鱗癌細(xì)胞的O_2和Ca~(2+)流的實驗研究31-44
• 1 材料32-33
• 2 實驗方法和步驟33-37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-39
• 5 附圖39-44
• 第二部分 孟加拉紅介導(dǎo)光動力療法抑制口腔鱗癌細(xì)胞增值的實驗研究44-55
• 1 材料44-45
• 2 實驗方法及步驟45-48
• 3 結(jié)果48-49
• 4 討論49-50
• 5 附圖50-55
• 第三部分 O_2和Ca~(2+)流的變化響應(yīng)光動力療法誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞凋亡信號的55-80
• 1 材料56-57
• 2 實驗方法及步驟57-64
• 3 結(jié)果64-66
• 4 討論66-71
• 5 附圖71-80
• 參考文獻(xiàn)80-89
• 發(fā)表的研究相關(guān)論文89-90
• 附件90-92
• 致謝92-93

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本文編號：804165