本文關(guān)鍵詞：pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表達(dá)質(zhì)粒中標(biāo)記基因的去除及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄的研究

  更多相關(guān)文章： 齲病 變異鏈球菌 標(biāo)記基因 番茄 瞬時(shí)表達(dá)

【摘要】：齲病(dental caries),俗稱蟲牙或蛀牙。它是牙體硬組織發(fā)生的慢性、進(jìn)行性破壞的疾病。其具有發(fā)病率高、分布廣等特點(diǎn),目前已嚴(yán)重影響到了人們的生活質(zhì)量。因此,需要尋找一種能有效降低患齲率的方法已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人類最主要的致齲菌,其中主要的致齲毒力因子是表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferases,GTFs),研究表明針對這兩種致齲毒力因子的抗體,可以有效抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展。因此,“免疫防齲”可成為當(dāng)今有效控制齲病的方法。本課題組針對這兩種毒力因子,成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p CAMBIA-E8-APB-DOCK8(簡稱p E8AD3),并轉(zhuǎn)化番茄獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。轉(zhuǎn)基因植物的食用安全和生態(tài)安全受到了人們的廣泛關(guān)注,目前轉(zhuǎn)基因植物的首要安全問題來源于標(biāo)記基因的存留,將標(biāo)記基因去除可消除人們對安全性的顧慮。本實(shí)驗(yàn)作為課題組實(shí)驗(yàn)的延續(xù),將融合基因表達(dá)質(zhì)粒p E8AD3中的標(biāo)記基因Km和GUS去除,并進(jìn)一步探索番茄瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng),為后續(xù)蛋白水平的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的:以課題組構(gòu)建的質(zhì)粒pE8AD3為基礎(chǔ),將選擇標(biāo)記基因Km和GUS去除,為后期番茄再生轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射法,建立番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),分析外源基因的表達(dá)情況。方法:1、運(yùn)用DNA重組技術(shù),將p E8AD3中的選擇性標(biāo)記基因Km和GUS去除。2、通過對番茄無菌苗的培育,觀察不同番茄品種的出芽數(shù)、成苗數(shù)及農(nóng)藝學(xué)性狀的差異顯著性,篩選出適用于本實(shí)驗(yàn)的番茄品種;將重組質(zhì)粒p E8AD3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,通過對番茄子葉、注射農(nóng)桿菌濃度、農(nóng)桿菌注射量、生長苗齡以及共培養(yǎng)天數(shù)進(jìn)行篩選,建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),觀察DOCK8基因的表達(dá)情況。3、番茄再生轉(zhuǎn)化中,通過對番茄子葉外植體的培育,侵染農(nóng)桿菌后的抑菌實(shí)驗(yàn),觀察羧芐青霉素、頭孢霉素、特美汀3種抗生素在不同抑菌濃度下的抑菌效果及外植體形態(tài)的變化,確立抑菌抗生素及濃度;運(yùn)用PCR檢測方法,對課題組獲得的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)進(jìn)行初步篩選。結(jié)果:1、成功獲得不含標(biāo)記基因Km和GUS的重組質(zhì)粒p E8AD3。2、建立番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),適合本實(shí)驗(yàn)的番茄品種為歐洲大紅(蘋果型),選材部位為番茄的子葉,注射農(nóng)桿菌濃度為OD600為0.2-0.7,農(nóng)桿菌注射量為50μL,苗齡為7-10 d,共培養(yǎng)24-48 h。3、番茄再生轉(zhuǎn)化中,特美汀作為一種有效抑制農(nóng)桿菌的抗生素,抑菌效果顯著,對植物影響小,特別適用于較難轉(zhuǎn)化的材料的轉(zhuǎn)基因過程,抑菌濃度為400 mg/L為宜,抑菌濃度過大或過小均會影響外植體的生長;PCR篩選出陽性番茄果實(shí)并保種。結(jié)論:1、獲得了可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的不含Km和GUS選擇標(biāo)記基因的融合基因表達(dá)載體p E8AD3,該載體含有果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8,APB中包含cat、Pac A和ctx B基因,以及胞質(zhì)分裂專一蛋白8(DOCK8)。2、建立并優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單,不需要昂貴的試劑和儀器,在短時(shí)間內(nèi)可分離蛋白,為進(jìn)一步探索目的蛋白的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為后期外源基因蛋白表達(dá)分析的研究提供一種方便、快捷和有效的方法。3、優(yōu)化出濃度為400 mg/L的特美汀抗生素作為番茄(歐洲大紅)轉(zhuǎn)基因選擇壓,該抗生素與其他抗生素相比,其優(yōu)點(diǎn)是能有效抑制農(nóng)桿菌的生長,對植物影響小,特別適用于較難轉(zhuǎn)化的材料的轉(zhuǎn)基因過程,尤其是農(nóng)桿菌OD值較高,很難被其他抗生素抑制時(shí)效果較為理想。4、獲得含GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因(p E8AD3)陽性番茄果實(shí),并成功用于種子的保存和繁育。
【關(guān)鍵詞】：齲病 變異鏈球菌 標(biāo)記基因 番茄 瞬時(shí)表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 中英縮略詞對照表7-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 第一章 載體p E8AD3中選擇標(biāo)記基因的去除16-35
• 1 儀器和材料16-19
• 1.1 主要儀器16
• 1.2 材料16-19
• 1.2.1 菌種和質(zhì)粒16-18
• 1.2.2 LB培養(yǎng)基18
• 1.2.3 抗生素18-19
• 1.2.4 實(shí)驗(yàn)試劑盒19
• 1.2.5 限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶19
• 1.2.6 其他19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線19-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)方法21-28
• 3 結(jié)果28-31
• 3.1 p E8AD3質(zhì)粒抽提、PCR及酶切結(jié)果28-30
• 3.2 測序結(jié)果30-31
• 4 討論31-35
• 4.1 選擇性標(biāo)記基因去除的目的及意義31-32
• 4.2 融合基因表達(dá)質(zhì)粒中標(biāo)記基因去除的方法32
• 4.3 標(biāo)記基因去除時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作32-33
• 4.4 研究現(xiàn)狀及展望33-35
• 第二章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)35-53
• 1 儀器和材料35-36
• 1.1 主要儀器35
• 1.2 材料35-36
• 1.2.1 植物材料35
• 1.2.2 質(zhì)粒及菌種35
• 1.2.3 培養(yǎng)基35-36
• 1.2.4 抗生素36
• 1.2.5 生物素36
• 1.2.6 生化試劑盒36
• 1.2.7 其他36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法36-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程36-37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法37-40
• 2.2.1 無菌苗的培育37-38
• 2.2.2 重組質(zhì)粒p E8AD3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA10538
• 2.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的制備38
• 2.2.4 番茄子葉注射及共培養(yǎng)38-39
• 2.2.5 番茄子葉總RNA的提取39
• 2.2.6 RNA逆轉(zhuǎn)錄c DNA39-40
• 2.2.7 PCR檢測不同條件下番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)情況40
• 3 結(jié)果40-49
• 3.1 無菌苗的生長過程40-42
• 3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42-43
• 3.3 p E8AD3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105及PCR鑒定結(jié)果43-44
• 3.4 m RNA水平檢測DOCK8在番茄中的表達(dá)44-49
• 4 討論49-53
• 4.1 瞬時(shí)表達(dá)研究的目的和意義49-50
• 4.2 瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法50
• 4.3 結(jié)果與分析50-52
• 4.4 研究現(xiàn)狀及展望52-53
• 第三章 不同抗生素和濃度對番茄外植體的影響及轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的初步篩選53-68
• 1 儀器和材料53-54
• 1.1 主要儀器53
• 1.2 材料53-54
• 1.2.1 植物材料53
• 1.2.2 質(zhì)粒及菌種53
• 1.2.3 培養(yǎng)基53-54
• 1.2.4 抗生素54
• 1.2.5 其他54
• 2 實(shí)驗(yàn)方法54-57
• 2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化番茄的研究54-55
• 2.1.1 重組質(zhì)粒p E8AD3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA10554
• 2.1.2 外植體的預(yù)備54-55
• 2.1.3 侵染55
• 2.1.4 共培養(yǎng)55
• 2.1.5 抑菌濃度的確立55
• 2.2 番茄果實(shí)的初步篩選55-57
• 2.2.1 植物基因組提取55-56
• 2.2.2 GUS檢測56-57
• 3 結(jié)果57-66
• 3.1 番茄外植體預(yù)培養(yǎng)57-58
• 3.2 抑菌抗生素及培養(yǎng)基濃度的確立58-59
• 3.3 轉(zhuǎn)基因番茄生長過程59-61
• 3.4 植物組DNA提取、GUS檢測結(jié)果61-66
• 4 討論66-68
• 4.1 抗生素的選擇及抑菌濃度確立的目的和意義66
• 4.2 不同抗生素抑菌效果分析66-67
• 4.3 檢測方法67-68
• 結(jié)論68-69
• 附錄 169-70
• 附錄 270-77
• 參考文獻(xiàn)77-82
• 綜述（一）82-94
• 參考文獻(xiàn)90-94
• 綜述（二）94-106
• 參考文獻(xiàn)102-106
• 致謝106-107
• 作者簡介107-108

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