本文關鍵詞：變形鏈球菌及其耐氟菌株耐酸基因hrcA的測序及甲基化水平分析

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【摘要】：目的:齲病(dental caries)是在以細菌為主的多種因素作用下,牙體硬組織,發(fā)生慢性進行性破壞性的一種疾病。變形鏈球菌(S.mutans)是目前公認致齲的主要致病菌[6-9],其致齲性主要取決于其產(chǎn)酸性和耐酸性[10]。近些年,氟化物已廣泛應用于臨床防齲,但長期大量使用氟化物可能會導致耐氟菌株的產(chǎn)生。研究證實S.mutans耐氟菌株的產(chǎn)酸、耐酸的能力均強于親代菌株,導致了耐氟菌株致齲性增強[48]。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學現(xiàn)象,是指在DNA甲基轉移酶的催化下,利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基,將特異位點甲基化,是不改變DNA序列的可遺傳的基因修飾作用。它參與調控基因表達、基因印記、轉座子沉默、胚胎發(fā)育、X染色體失活以及癌癥發(fā)生等重要生物學過程。DNA甲基化能夠引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變,從而調控基因的表達[49]。研究表明在細菌中DNA甲基化在調節(jié)與毒力有關的功能方面起到一個很重要的角色[2]。目前,學者對變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關基因fhs、ffh、dgk、dltc、ccpA、dltC、comD[5-7]等都已進行了基因突變位點的檢測。但是耐酸相關基因hrcA是否突變還不可知。迄今為止,國內外的研究僅限于對S.mutans耐氟菌株基因水平的檢測,而對于基因表觀遺傳學修飾,尤其是DNA甲基化的研究仍是空白,需要大量探索。因此本實驗旨在基因水平上對S.mutans耐氟菌株耐酸相關基因hrc A進行結構基因突變的檢測,明確hrcA結構基因是否發(fā)生突變。又采用MiSeq亞硫酸氫鹽修飾高通量二代測序法對耐酸相關基因hrcA進行甲基化測序,確定耐氟菌株與其親代菌株甲基化水平是否一致。我們希望通過對S.mutans耐氟菌株耐酸相關基因hrcA基因測序和甲基化水平的分析,更深刻的揭示耐酸性增強的機制,也為齲病的防治提供新的思路和理論指導。方法:1.S.mutans及其耐氟菌株的復蘇、培養(yǎng)與鑒定。2.S.mutans全基因組的提取。3.目的基因hrcA的PCR擴增及純化。4.構建重組質粒:目的基因hrcA的PCR產(chǎn)物與PMD-18T載體連接,轉化入E.coli感受態(tài)細胞(DH5α)中。5.重組質粒的提取、鑒定及測序6.目的基因hrcA甲基化水平的檢測結果:1.經(jīng)16SrDNA鑒定證實實驗培養(yǎng)的細菌為S.mutans耐氟菌株(UA159-FR)。2.成功構建重組質粒。3.重復測序三次,將測序結果與Genbank上公布的S.mutans UA159的基因進行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)目的基因hrcA的結構基因序列無突變。4.S.mutans耐氟菌株與其親代菌株的目的基因hrcA甲基化水平檢測無顯著差異。結論:成功構建了S.mutans耐氟菌株耐酸相關基因hrcA重組質粒,鑒定后進行基因測序,發(fā)現(xiàn)hrcA的結構基因序列無突變,并且S.mutans與其耐氟菌株的耐酸相關基因hrcA甲基化水平檢測無顯著差異。表明耐氟菌株的致齲性增強與耐酸相關基因hrcA的突變和甲基化無明顯關系。耐氟菌株致齲性增強的具體原因和機制還需要進一步研究。
【關鍵詞】：S.mutans耐氟菌株 耐酸相關基因 hrcA 基因突變 甲基化
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞表12-13
• 第1章 引言13-15
• 第2章 文獻回顧15-19
• 2.1 齲病及變形鏈球菌耐氟菌株的概述15
• 2.2 S.mutans耐氟菌株的鑒定15-16
• 2.3 S.mutans耐氟菌株耐酸相關基因hrcA的研究意義16-17
• 2.4 DNA甲基化的研究進展17
• 2.5 DNA甲基化的檢測方法17-19
• 第3章 實驗19-31
• 3.1 材料19-21
• 3.1.1 細菌19
• 3.1.2 儀器19
• 3.1.3 培養(yǎng)基與試劑盒19-20
• 3.1.4 常用培養(yǎng)基的配制20-21
• 3.2 實驗方法21-31
• 3.2.1 變形鏈球菌（UA159）及其耐氟菌株（UA159-FR）的復蘇和培養(yǎng)21
• 3.2.2 變形鏈球菌（UA159）及其耐氟菌株（UA159-FR）的鑒定21-24
• 3.2.3 目的基因引物的設計與合成24-25
• 3.2.4 PCR擴增25
• 3.2.5 瓊脂糖凝膠電泳（AGE）鑒定PCR產(chǎn)物25
• 3.2.6 PCR產(chǎn)物回收25
• 3.2.7 瓊脂糖凝膠電泳（AGE）鑒定回收后PCR產(chǎn)物25-26
• 3.2.8 PCR產(chǎn)物的酶切26
• 3.2.9 酶切后PCR產(chǎn)物的純化26-27
• 3.2.10 連接27
• 3.2.11 轉化27
• 3.2.12 接種到LB液體培養(yǎng)基27
• 3.2.13 提取重組質粒27-28
• 3.2.14 鑒定重組質粒28-29
• 3.2.15 hrcA甲基化水平檢測29-31
• 第4章 結果31-42
• 4.1 S.mutans UA159及其耐氟菌株UA159-FR的復蘇和培養(yǎng)31
• 4.2 S.mutans UA159及其耐氟菌株UA159-FR的鑒定31-32
• 4.3 目的基因hrcA的PCR產(chǎn)物及鑒定32
• 4.4 PCR純化產(chǎn)物的鑒定32-33
• 4.5 感受態(tài)細胞（E.coli DH5α）的培養(yǎng)33
• 4.6 重組質粒的鑒定33-34
• 4.7 重組質粒酶切產(chǎn)物的鑒定34
• 4.8 目的基因hrcA的測序結果34-39
• 4.9 hrcA甲基化水平檢測結果39-42
• 4.9.1 甲基化堿基覆蓋深度39-40
• 4.9.2 甲基化測序位點偏向性40-41
• 4.9.3 甲基化差異性分析41-42
• 第5章 討論42-44
• 第6章 結論44-45
• 參考文獻45-50
• 導師簡介50-51
• 作者簡介51-52
• 致謝52

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫德利,舒琦瑾;基因表達譜在中醫(yī)藥研究中的意義[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2002年01期

2 劉s，

本文編號：773184