牙齒再生是采用人體的組織或細(xì)胞,在體外再生出具有正常形態(tài),大小及生物功能的牙齒來(lái)取代傳統(tǒng)方法用于修復(fù)受損牙齒的目的。本篇論文主要采用慢病毒介導(dǎo)技術(shù)對(duì)提高人牙髓干細(xì)胞的牙向分化的潛能進(jìn)行研究,找出一種在牙髓干細(xì)胞牙向分化過程中起重要作用的關(guān)鍵因子,提高牙髓干細(xì)胞牙向分化的能力,為牙齒再生的組織工程研究提供種子細(xì)胞與方法依據(jù)。在本篇論文的研究工作中,我們分離和培養(yǎng)了成人的牙髓干細(xì)胞,先后克隆了三種在牙齒發(fā)育過程中起重要作用的因子于慢病毒載體上,大量生產(chǎn)并濃縮出高滴度的病毒顆粒對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行分組誘導(dǎo),為后期研究牙髓干細(xì)胞牙向分化潛能的工作奠定基礎(chǔ)。通過一系列的檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn):同感染空載病毒相比較,感染攜帶有目的基因的牙髓干細(xì)胞能夠表達(dá)牙本質(zhì)細(xì)胞特異蛋白DSPP,而過表達(dá)了基因MSX1的牙髓干細(xì)胞比過表達(dá)PAX9和BMP4的牙髓干細(xì)胞分泌出更多的DSP,osteocalcin,osteopontin等牙齒結(jié)構(gòu)特異性蛋白;同時(shí)被攜帶有MSX1慢病毒感染的牙髓干細(xì)胞堿性磷酸酶活性最高;鈣化程度也最高。這表明牙髓干細(xì)胞具有在體外被誘導(dǎo)為牙本質(zhì)細(xì)胞的潛能,同時(shí)基因MSX1是牙髓干細(xì)胞牙向分化過程中的關(guān)...

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中文文摘
緒論
第一章 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和載體
        1.1.2 細(xì)胞
        1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備
        1.1.4 主要試劑和器皿
        1.1.5 試劑配方
        1.1.6 RT-PCR引物
    1.2 方法
        1.2.1 攜帶有目的基因的慢病毒載體的制備
        1.2.2 慢病毒的生產(chǎn)
            1.2.2.1 大量提取慢病毒包裝質(zhì)粒
            1.2.2.2 293T細(xì)胞的擴(kuò)培與凍存
            1.2.2.3 磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,大量生產(chǎn)慢病毒
            1.2.2.4 慢病毒液的收集與濃縮
            1.2.2.5 測(cè)定病毒滴度
            1.2.2.6 最佳MOI的確定
        1.2.3 牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)及感染
        1.2.4 被感染后牙髓干細(xì)胞的鑒定
            1.2.4.1 RT-PCR
            1.2.4.2 測(cè)定堿性磷酸酶活性
            1.2.4.3 HE染色
            1.2.4.4 免疫組化
            1.2.4.5 茜素紅染色測(cè)鈣化
第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.1 牙髓干細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)
    2.2 構(gòu)建攜帶目的基因的慢病毒載體的鑒定
        2.2.1 慢病毒生產(chǎn)后的鑒定
        2.2.2 慢病毒滴度的測(cè)定
        2.2.3 最佳感染復(fù)數(shù)的確定
    2.3 過表達(dá)后牙髓干細(xì)胞組織形態(tài)的變化
    2.4 過表達(dá)后牙髓干細(xì)胞牙向分化的檢測(cè)
        2.4.1 RT-PCR檢測(cè)過表達(dá)后的牙髓干細(xì)胞能夠表達(dá)DSPP
        2.4.2 過表達(dá)的牙髓干細(xì)胞能夠提高堿性磷酸酶活性
        2.4.3 過表達(dá)的牙髓干細(xì)胞能夠分泌牙本質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白
        2.4.4 茜素紅檢測(cè)鈣化程度
第三章 分析與討論
    3.1 過表達(dá)基因BMP4、MSX1和PAX9的選擇
    3.2 影響慢病毒轉(zhuǎn)染效率的因素及MOI的確定
    3.3 牙髓干細(xì)胞牙向分化的檢測(cè)
第四章 結(jié)論
    4.1 成功構(gòu)建分別攜帶三種目的基因的慢病毒載體
    4.2 生產(chǎn)出具有高滴度的三種病毒并確定最佳感染復(fù)數(shù)
    4.3 過表達(dá)的牙髓干細(xì)胞能夠向牙齒方向分化
    4.4 基因MSX1能夠增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞牙向分化的能力
附錄1 質(zhì)粒圖譜
附錄2 測(cè)序報(bào)告單
附錄3 英文縮略語(yǔ)表
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：4035295