本文關(guān)鍵詞：LPS對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖定向分化能力的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來隨著人們對(duì)成體干細(xì)胞的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)其在組織再生和損傷修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用。牙髓干細(xì)胞作為存在于牙髓組織的一種成體干細(xì)胞，也是口腔生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它具有很強(qiáng)的增殖能力，在體外經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)又能向成骨/成牙、成脂、成神經(jīng)等方向分化。同時(shí)眾多的研究也發(fā)現(xiàn)移植到體內(nèi)的牙髓干細(xì)胞能夠形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。因此，牙髓干細(xì)胞成功體外分離為構(gòu)建組織工程牙齒和牙髓損傷修復(fù)的研究提供了重大的契機(jī)。 細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠與細(xì)胞表面特異性受體TLR4結(jié)合調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。而齲病致牙髓損傷時(shí)，，脫礦牙本質(zhì)能釋放TGFβl等眾多生長因子，促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向OBLC分化。而細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物也會(huì)進(jìn)入牙髓，接觸刺激牙髓干細(xì)胞，那么細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物如LPS是否影響牙髓干細(xì)胞增殖和定向分化能力？目前尚不清楚。為此，本課題在成功構(gòu)建牙髓干細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，用LPS對(duì)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇碳�，旨在探索其�?duì)牙髓干細(xì)胞增殖分化能力的影響。我們還初步分析了MAPK信號(hào)通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程中作用。我們的研究結(jié)果如下： 1.牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 我們通過酶消化組織塊法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞，采用有限稀釋法對(duì)得到的原代細(xì)胞進(jìn)行純化，獲得相對(duì)較為純化均一的牙髓干細(xì)胞系。然后，我們采用了一系列針對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的方法對(duì)獲得的干細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的表型進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)細(xì)胞多向分化能力的進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均符合公認(rèn)的DPSCs的生物學(xué)特征，證明我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了hDPSCs細(xì)胞系。 2. LPS對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響 我們通過LPS刺激二維平面和三維立體培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞檢測(cè)其對(duì)hDPSCs增殖能力的影響。不同濃度的LPS（0.01-10ug/ml）刺激二維平面培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示LPS在短時(shí)間的培養(yǎng)時(shí)間（1-5d）內(nèi)對(duì)hDPSCs的增殖能力影響不大，7d時(shí)與無刺激因素的對(duì)照組相比，各刺激組均出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象；而用1ug/mlLPS刺激復(fù)合在HA/TCP支架材料上三維立體培養(yǎng)的hDPSCs，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)7d組與3d組比較細(xì)胞數(shù)目明顯增多；而3d、7d分別將對(duì)照組與LPS刺激組相比細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，14d時(shí)LPS刺激組較對(duì)照組相比細(xì)胞數(shù)目明顯減少。提示LPS長期刺激牙髓干細(xì)胞可能會(huì)抑制其增殖能力。 3. LPS對(duì)人牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響 首先，我們通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在牙髓干細(xì)胞分化過程中TLR4及相關(guān)礦化基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TLR4在牙髓干細(xì)胞表面表達(dá)，而且牙髓干細(xì)胞分化7天時(shí)表達(dá)達(dá)到最高峰，提示LPS特異性受體TLR4很可能在牙髓干細(xì)胞分化早期發(fā)揮重要作用。礦化基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN在牙髓干細(xì)胞在分化過程中均有不同程度的升高。隨后，我們分別通過實(shí)時(shí)定量PCR和茜素紅染色分別檢測(cè)LPS在牙髓干細(xì)胞分化過程中對(duì)礦化相關(guān)基因表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)形成情況的影響，結(jié)果顯示LPS能夠顯著的促進(jìn)礦化相關(guān)基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN的表達(dá)；同時(shí)LPS刺激也能促進(jìn)牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。我們又通過電鏡觀察LPS對(duì)三維培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌情況的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)及膠原纖維樣結(jié)構(gòu)的形成。以上結(jié)果證實(shí)LPS能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的定向分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。以上研究結(jié)果與體內(nèi)牙髓損傷修復(fù)的過程類似，該部分的研究為探明牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制提供了可靠的體外研究模型。 4. MAPK信號(hào)通路在LPS調(diào)控的人牙髓干細(xì)胞定向分化過程中作用的研究 為了探索牙髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制，我們對(duì)MAPK信號(hào)通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞定向分化過程的作用也進(jìn)行了初步的分析。通過茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色和實(shí)時(shí)定量PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)同時(shí)阻斷ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路后，LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)和礦化基因表達(dá)均發(fā)生明顯的降低，而阻斷JNK對(duì)兩者的影響卻不是很顯著。另外，Westernblot檢測(cè)結(jié)果也顯示LPS能夠活化p38、ERK1/2激酶，且酶的活性隨著LPS作用時(shí)間的延長而明顯增強(qiáng)。說明ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路參與了LPS對(duì)牙髓干細(xì)胞的定向分化過程的調(diào)控，并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用，而JNK信號(hào)通路可能不參與其中。這為探索牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 綜上所述，LPS對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2和p38MAPK信號(hào)通路參與LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程，并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用。本項(xiàng)研究為牙髓損傷修復(fù)機(jī)制的研究提供了一定的基礎(chǔ)，也為臨床活髓保存治療提供了一定的思路。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細(xì)胞 LPS 增殖 定向分化 MAPKs信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781.3
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-21
• 實(shí)驗(yàn)一 人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定21-27
• 1 材料21-22
• 1.1 主要試劑21
• 1.2 主要儀器設(shè)備21-22
• 2 方法22-24
• 2.1 人牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.2 牙髓干細(xì)胞鑒定23-24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25-27
• 實(shí)驗(yàn)二 LPS 對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響27-32
• 1 材料27-28
• 1.1 主要試劑27
• 1.2 主要儀器27-28
• 2 方法28-29
• 2.1 不同濃度 LPS 對(duì)二維培養(yǎng)的 hDPSCs 體外增殖能力的影響28
• 2.2 電鏡觀察 LPS 對(duì)三維培養(yǎng)的 hDPSCs 體外增殖能力的影響28-29
• 3 結(jié)果29-30
• 4 討論30-32
• 實(shí)驗(yàn)三 LPS 對(duì)人牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響32-42
• 1 材料32-33
• 1.1 主要試劑32
• 1.2 主要儀器32-33
• 2 方法33-37
• 2.1 在牙髓干細(xì)胞分化過程中 TLR4 及相關(guān)礦化基因 DSPP、DMP1、OPN、ALP mRNA 表達(dá)情況33-36
• 2.2 LPS 在牙髓干細(xì)胞定向分化過程中作用36-37
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-42
• 實(shí)驗(yàn)四 MAPK 信號(hào)通路在 LPS 調(diào)控的人牙髓干細(xì)胞定向分化中作用的研究42-48
• 1. 材料42-43
• 1.1 主要試劑42-43
• 1.2 主要設(shè)備43
• 2. 方法43-45
• 2.1 牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)43
• 2.2 MAPK 信號(hào)通路抑制劑對(duì) LPS 調(diào)控的牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響43-44
• 2.2.1 茜素紅染色分析43
• 2.2.2 礦化相關(guān)基因 DSPP、DMP1、ALP、OPN mRNA 水平檢測(cè)43-44
• 2.3 Western blot 檢測(cè) LPS 刺激 hDPSCs 時(shí) MAPK 信號(hào)通路的蛋白活化水平44-45
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• 3. 結(jié)果45-46
• 4. 討論46-48
• 小結(jié)48-50
• 參考文獻(xiàn)50-60
• 附錄60-67
• 個(gè)人簡歷和研究成果67-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：355888