本文關(guān)鍵詞：LPS對人牙髓干細(xì)胞增殖定向分化能力的影響及其相關(guān)機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來隨著人們對成體干細(xì)胞的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)其在組織再生和損傷修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮著非常重要的作用。牙髓干細(xì)胞作為存在于牙髓組織的一種成體干細(xì)胞，也是口腔生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。它具有很強的增殖能力，在體外經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)又能向成骨/成牙、成脂、成神經(jīng)等方向分化。同時眾多的研究也發(fā)現(xiàn)移植到體內(nèi)的牙髓干細(xì)胞能夠形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)。因此，牙髓干細(xì)胞成功體外分離為構(gòu)建組織工程牙齒和牙髓損傷修復(fù)的研究提供了重大的契機。 細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠與細(xì)胞表面特異性受體TLR4結(jié)合調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。而齲病致牙髓損傷時，，脫礦牙本質(zhì)能釋放TGFβl等眾多生長因子，促進牙髓干細(xì)胞向OBLC分化。而細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物也會進入牙髓，接觸刺激牙髓干細(xì)胞，那么細(xì)菌及其毒性產(chǎn)物如LPS是否影響牙髓干細(xì)胞增殖和定向分化能力？目前尚不清楚。為此，本課題在成功構(gòu)建牙髓干細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，用LPS對牙髓干細(xì)胞進行適當(dāng)?shù)拇碳�，旨在探索其對牙髓干�?xì)胞增殖分化能力的影響。我們還初步分析了MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程中作用。我們的研究結(jié)果如下： 1.牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 我們通過酶消化組織塊法分離培養(yǎng)原代細(xì)胞，采用有限稀釋法對得到的原代細(xì)胞進行純化，獲得相對較為純化均一的牙髓干細(xì)胞系。然后，我們采用了一系列針對干細(xì)胞生物學(xué)特性的方法對獲得的干細(xì)胞進行了鑒定。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的表型進行分析，同時對細(xì)胞多向分化能力的進行了檢測，結(jié)果均符合公認(rèn)的DPSCs的生物學(xué)特征，證明我們已經(jīng)成功的構(gòu)建了hDPSCs細(xì)胞系。 2. LPS對人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響 我們通過LPS刺激二維平面和三維立體培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞檢測其對hDPSCs增殖能力的影響。不同濃度的LPS（0.01-10ug/ml）刺激二維平面培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞，MTT檢測結(jié)果顯示LPS在短時間的培養(yǎng)時間（1-5d）內(nèi)對hDPSCs的增殖能力影響不大，7d時與無刺激因素的對照組相比，各刺激組均出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象；而用1ug/mlLPS刺激復(fù)合在HA/TCP支架材料上三維立體培養(yǎng)的hDPSCs，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)7d組與3d組比較細(xì)胞數(shù)目明顯增多；而3d、7d分別將對照組與LPS刺激組相比細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，14d時LPS刺激組較對照組相比細(xì)胞數(shù)目明顯減少。提示LPS長期刺激牙髓干細(xì)胞可能會抑制其增殖能力。 3. LPS對人牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響 首先，我們通過實時定量PCR檢測在牙髓干細(xì)胞分化過程中TLR4及相關(guān)礦化基因表達情況，發(fā)現(xiàn)TLR4在牙髓干細(xì)胞表面表達，而且牙髓干細(xì)胞分化7天時表達達到最高峰，提示LPS特異性受體TLR4很可能在牙髓干細(xì)胞分化早期發(fā)揮重要作用。礦化基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN在牙髓干細(xì)胞在分化過程中均有不同程度的升高。隨后，我們分別通過實時定量PCR和茜素紅染色分別檢測LPS在牙髓干細(xì)胞分化過程中對礦化相關(guān)基因表達和礦化結(jié)節(jié)形成情況的影響，結(jié)果顯示LPS能夠顯著的促進礦化相關(guān)基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN的表達；同時LPS刺激也能促進牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。我們又通過電鏡觀察LPS對三維培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞胞外基質(zhì)分泌情況的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激能夠促進牙髓干細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)及膠原纖維樣結(jié)構(gòu)的形成。以上結(jié)果證實LPS能夠促進牙髓干細(xì)胞的定向分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。以上研究結(jié)果與體內(nèi)牙髓損傷修復(fù)的過程類似，該部分的研究為探明牙髓損傷修復(fù)的機制提供了可靠的體外研究模型。 4. MAPK信號通路在LPS調(diào)控的人牙髓干細(xì)胞定向分化過程中作用的研究 為了探索牙髓損傷修復(fù)的分子機制，我們對MAPK信號通路在LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞定向分化過程的作用也進行了初步的分析。通過茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色和實時定量PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)同時阻斷ERK1/2和p38MAPK信號通路后，LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)和礦化基因表達均發(fā)生明顯的降低，而阻斷JNK對兩者的影響卻不是很顯著。另外，Westernblot檢測結(jié)果也顯示LPS能夠活化p38、ERK1/2激酶，且酶的活性隨著LPS作用時間的延長而明顯增強。說明ERK1/2和p38MAPK信號通路參與了LPS對牙髓干細(xì)胞的定向分化過程的調(diào)控，并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用，而JNK信號通路可能不參與其中。這為探索牙髓損傷修復(fù)的機制研究奠定了一定的基礎(chǔ)。 綜上所述，LPS對牙髓干細(xì)胞的增殖能力和定向分化能力均有不同程度的影響，進一步研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2和p38MAPK信號通路參與LPS調(diào)控的牙髓干細(xì)胞分化過程，并在其中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用。本項研究為牙髓損傷修復(fù)機制的研究提供了一定的基礎(chǔ)，也為臨床活髓保存治療提供了一定的思路。
【關(guān)鍵詞】：牙髓干細(xì)胞 LPS 增殖 定向分化 MAPKs信號通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.3
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-21
• 實驗一 人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定21-27
• 1 材料21-22
• 1.1 主要試劑21
• 1.2 主要儀器設(shè)備21-22
• 2 方法22-24
• 2.1 人牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.2 牙髓干細(xì)胞鑒定23-24
• 3 結(jié)果24-25
• 4 討論25-27
• 實驗二 LPS 對人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響27-32
• 1 材料27-28
• 1.1 主要試劑27
• 1.2 主要儀器27-28
• 2 方法28-29
• 2.1 不同濃度 LPS 對二維培養(yǎng)的 hDPSCs 體外增殖能力的影響28
• 2.2 電鏡觀察 LPS 對三維培養(yǎng)的 hDPSCs 體外增殖能力的影響28-29
• 3 結(jié)果29-30
• 4 討論30-32
• 實驗三 LPS 對人牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響32-42
• 1 材料32-33
• 1.1 主要試劑32
• 1.2 主要儀器32-33
• 2 方法33-37
• 2.1 在牙髓干細(xì)胞分化過程中 TLR4 及相關(guān)礦化基因 DSPP、DMP1、OPN、ALP mRNA 表達情況33-36
• 2.2 LPS 在牙髓干細(xì)胞定向分化過程中作用36-37
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析37
• 3 結(jié)果37-38
• 4 討論38-42
• 實驗四 MAPK 信號通路在 LPS 調(diào)控的人牙髓干細(xì)胞定向分化中作用的研究42-48
• 1. 材料42-43
• 1.1 主要試劑42-43
• 1.2 主要設(shè)備43
• 2. 方法43-45
• 2.1 牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)43
• 2.2 MAPK 信號通路抑制劑對 LPS 調(diào)控的牙髓干細(xì)胞定向分化能力的影響43-44
• 2.2.1 茜素紅染色分析43
• 2.2.2 礦化相關(guān)基因 DSPP、DMP1、ALP、OPN mRNA 水平檢測43-44
• 2.3 Western blot 檢測 LPS 刺激 hDPSCs 時 MAPK 信號通路的蛋白活化水平44-45
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)分析45
• 3. 結(jié)果45-46
• 4. 討論46-48
• 小結(jié)48-50
• 參考文獻50-60
• 附錄60-67
• 個人簡歷和研究成果67-68
• 致謝68

【參考文獻】

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10 蔣宏偉,凌均h

本文編號：355888