目的:本項目擬制備殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米粒（CS/CMCS-NPs）負(fù)載多西環(huán)素（Dox）后形成的復(fù)合納米粒體系（Dox:CS/CMCS-NPs）,研究其理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性和抗菌性能;構(gòu)建人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）中由牙齦卟啉單胞菌脂多糖（P.gingivalis-LPS）和三磷酸腺苷（ATP）聯(lián)合誘導(dǎo)而出的NLRP3炎癥小體模型,研究Dox:CS/CMCS-NPs復(fù)合納米粒體系對人牙齦成纖維細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的抑制作用。方法:1.人牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)、鑒定及NLRP3炎癥小體模型的構(gòu)建與抑制:組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代人牙齦成纖維細(xì)胞,采用免疫熒光法對其進(jìn)行鑒定;用牙齦卟啉單胞菌脂多糖聯(lián)合三磷酸腺苷誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞構(gòu)建NLRP3炎癥小體模型,并用多西環(huán)素調(diào)控細(xì)胞模型,實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、酶聯(lián)免疫吸附法及蛋白質(zhì)印跡法檢測其相關(guān)mRNA及蛋白的表達(dá)量。2.包載多西環(huán)素的復(fù)合納米粒體系Dox:CS/CMCS-NPs及不包載多西環(huán)素的納米粒CS/CMCS-NPs的制備及性質(zhì)檢測:采用離子交聯(lián)法制備Dox:CS/CMCSNPs及CS/CMCS-NPs復(fù)合納米粒體系;采用... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

光學(xué)顯微鏡下原代細(xì)胞照片(A)；熒光顯微鏡下原代細(xì)胞照片(B,C)

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文9CCK-8結(jié)果，選定1.0μg/ml為本實驗建立炎癥小體細(xì)胞模型的P.gingivalis-LPS濃度。圖2低倍鏡下HGFs經(jīng)P.gingivalis-LPS(0,0.25,0.5,1.0,2.0,5.0μg/ml)刺激12小時及48小時的細(xì)胞照片(A)；HGFs經(jīng)P.gingivalis-LPS(0,0.25,0.5,1.0,2.0,5.0μg/ml)刺激12小時、24小時及48小時的CCK-8檢測結(jié)果(B)。圖3HGFs經(jīng)P.gingivalis-LPS(0,0.25,0.5,1.0,2.0,5.0μg/ml)刺激12小時后Pro-caspase-1的蛋白表達(dá)量(A)及其灰度值分析(B)。

第一章多西環(huán)素抑制牙周炎的作用機(jī)制103.3多西環(huán)素適宜濃度的篩選如圖4所示，牙齦成纖維細(xì)胞在1.0,5.0,10.0,20.0及50.0μg/ml濃度的多西環(huán)素刺激下，培養(yǎng)3小時及5小時后的OD值與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而在培養(yǎng)7小時后，可見10.0μg/ml組相較于對照組OD值明顯升高(P<0.05)，說明細(xì)胞的增殖能力較對照組增強(qiáng)。20.0與50.0μg/ml組的牙齦成纖維細(xì)胞與對照組相比OD值無統(tǒng)計學(xué)差異，一定程度上說明多西環(huán)素的濃度過大會抑制細(xì)胞的生長。圖4HGFs在不同濃度多西環(huán)素(0,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg/ml)下的CCK-8結(jié)果3.4人牙齦成纖維細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的表達(dá)與抑制如圖5A-D所示，LPS組、ATP組與Dox組中NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)量與空白組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；當(dāng)用LPS和ATP共同刺激牙齦成纖維細(xì)胞時，NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)量與空白組相比明顯升高(P<0.05)；當(dāng)用Dox刺激LPS+ATP組時，NLRP3炎癥小體相關(guān)mRNA的表達(dá)量均有所下降(P<0.05)，但對比空白組仍較高(P<0.05)。單獨使用LPS時，細(xì)胞上清液中IL-1β的蛋白表達(dá)量相比空白組有所上升；當(dāng)加入ATP協(xié)同作用時，IL-1β的蛋白表達(dá)量急劇升高，差異具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而應(yīng)用Dox可以顯著降低細(xì)胞上清液中IL-1β的蛋白表達(dá)量(P<0.05)（圖5E）。


本文編號：3341248