研究目的：明確牙本質(zhì)非膠原蛋白（dentin non-collagenous proteins,DNCPs）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs）增殖及牙/骨向分化能力的影響，為牙髓組織再生研究及牙髓治療由傳統(tǒng)物理充填治療向生物學(xué)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：通過全骨髓貼壁法獲取大鼠BMMSCs并對其組織來源進(jìn)行鑒定，取第3⁵代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)：采用MTT法及堿性磷酸酶活性測定確定DNCPs的最佳作用濃度，并繪制生長曲線，計(jì)算群體倍增時(shí)間；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期計(jì)算增殖指數(shù)（PI）。采用堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡檢測DNCPs對大鼠BMMSCs的增殖和牙/骨向分化能力的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以1×106密度收集DNCPs誘導(dǎo)7d后及未誘導(dǎo)的BMMSCs分別與羥基磷灰石復(fù)合后移植到大鼠的腎被膜下，3W后取材、固定、脫礦、包埋、連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色觀察移植物的組織形態(tài)，并通過偏振光顯微鏡觀察形成組織的纖維排列方向。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：培養(yǎng)的大鼠B... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

全骨髓貼壁法培養(yǎng)的BMMSCs形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)觀察A：BMMSCs抗VIM染色陽性，胞質(zhì)呈現(xiàn)出褐色強(qiáng)染色；B：BMMSCs抗CK染色陰性，胞質(zhì)未見黃色染色；C：PBS對照無著色，胞質(zhì)無黃色染色；D：BMMSCs

圖 1.2 BMMSCs 的增殖狀況及細(xì)胞周期分布A：BMMSCs 在接種后第 3 d 左右進(jìn)入對數(shù)生長期，第 7 d 左右進(jìn)入平臺期，整體生長曲線呈“S”形，PDT 為 48.5±2.8 h；B：BMMSCs FCM 分析細(xì)胞周期分布，G0/G1期、S 期及 G2/M 期比例分別為 74.09%、21.25%及 4.66%，BMMSCs的增殖指數(shù)（G2/M+S）為 25.91%。3 討論由于BMMSCs在骨髓中的含量不高，很難滿足實(shí)際應(yīng)用需要，因此，建立穩(wěn)定的BMMSCs培養(yǎng)體系，對其進(jìn)行體外的大量擴(kuò)增成為首先面對的問題。目前常用的BMMSCs的分離培養(yǎng)方法有全骨髓貼壁法，密度梯度離心法，流式細(xì)胞儀篩選及免疫磁珠篩選等。本實(shí)驗(yàn)利用操作相對簡單的全骨髓貼壁法獲取BMMSCs，所得細(xì)胞具備間充質(zhì)來源干細(xì)胞的特征。首先是骨髓來源。因?yàn)榧?xì)胞采用的是全骨髓貼壁法，所以細(xì)胞來源于骨髓無可厚非，且通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞角蛋白染色陰性，波形

圖 2.1 DNCPs 最佳作用濃度的確定A：DNCPs 以濃度為 0、0.1、1、10、100 μg/mL 作用于細(xì)胞 3 d 后，MTT 法檢測不同濃度 DNCPs 對細(xì)胞增殖能力的影響，在濃度為 0.1 ~ 10 μg/mL 時(shí)，DNCPs對 BMMSCs 的增殖能力無明顯的促進(jìn)作用，數(shù)值雖依次上升，并無顯著性差異（P>0.05），在 100 μg/mL 時(shí)相對 Control 組增殖能力下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異（P>0.05）；B：ALP 活性在 DNCPs 濃度為 0.1、1 μg/mL 時(shí)，相對 Control 組無顯著性差異（P>0.05），DNCPs 濃度為 10、100 μg/mL 時(shí)，相對 Control 組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中 100 μg/mL 組低于 10 μg/mL 組，無顯著性差異（P>0.05）。因此，10 μg/mL 為 DNCPs 最佳作用濃度，以此濃度作用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。


本文編號：3340092