目的研究乳牙高致齲性變異鏈球菌（S.mutans）高溫需要蛋白A（HtrA）基因缺陷株和HtrA高毒力株在體外非應(yīng)激環(huán)境中生物膜形成的差異。方法用分光光度計(jì)比濁法測(cè)定前期獲得的乳牙高致齲性S.mutans HtrA高毒力株、基因缺陷株和S.mutans國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株UA159的生長(zhǎng)情況;體外構(gòu)建三菌株生物膜模型,掃描電鏡下觀察生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu);結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)評(píng)估形成生物膜的量。結(jié)果 3組S.mutans增殖的各個(gè)階段,與HtrA基因缺陷株相比,HtrA高毒力株與UA159標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌濃度(OD₆₀₀值)更高（P<0.05）。掃描電鏡下觀察HtrA高毒力株密度最大,UA159標(biāo)準(zhǔn)株次之,HtrA缺陷株密度最低。與HtrA基因缺陷株相比,生物膜結(jié)晶紫半定量測(cè)定4、8、12、24 h HtrA高毒力株OD₆₀₀值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論 S.mutans生物膜的形成受到HtrA的影響,HtrA基因的缺失會(huì)降低細(xì)菌的黏附和減緩生物膜的形成。 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,55(09)北大核心

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3組菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

生物膜是微生物黏附于牙面形成的復(fù)合體,是S.mutans賴以生存的微生態(tài)環(huán)境,它的形成包括兩個(gè)過(guò)程,即早期細(xì)菌黏附牙面和后期細(xì)菌相互作用、集聚。絲氨酸蛋白酶的HtrA家族分布廣泛,在多種細(xì)菌、植物及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)其同系物,這種蛋白酶具有管家蛋白的作用,能降解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),維持細(xì)菌的生理穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)外界應(yīng)激環(huán)境起重要作用[10]。Ahn et al[11]在S.mutans中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)HtrA基因的存在,并且證明了它不僅是調(diào)控S.mutans的生長(zhǎng)和耐熱性的關(guān)鍵因子,還是調(diào)控S.mutans某些基因轉(zhuǎn)錄和生物膜形成的關(guān)鍵因子。表1 3個(gè)菌株不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)晶紫染色OD600值 ( x ˉ ±s) 時(shí)間(h) 組別(n=10) F值 P值 UA159標(biāo)準(zhǔn)株 HtrA高毒力株 HtrA基因缺陷株 P1 P2 P3 4 0.460±0.067 0.856±0.082 0.403±0.121 70.670 <0.001 0.183 <0.001 8 0.754±0.135 1.130±0.077 0.672±0.061 64.506 <0.001 0.105 <0.001 12 1.014±0.147 1.171±0.111 0.862±0.165 11.701 0.021 0.024 <0.001 24 1.233±0.293 1.329±0.143 1.009±0.200 5.518 0.341 0.032 0.001 P1:HtrA高毒力株與UA159標(biāo)準(zhǔn)株比較;P2:UA159標(biāo)準(zhǔn)株與HtrA基因缺陷株比較;P3:HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株比較

表1 3個(gè)菌株不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)晶紫染色OD600值 ( x ˉ ±s) 時(shí)間(h) 組別(n=10) F值 P值 UA159標(biāo)準(zhǔn)株 HtrA高毒力株 HtrA基因缺陷株 P1 P2 P3 4 0.460±0.067 0.856±0.082 0.403±0.121 70.670 <0.001 0.183 <0.001 8 0.754±0.135 1.130±0.077 0.672±0.061 64.506 <0.001 0.105 <0.001 12 1.014±0.147 1.171±0.111 0.862±0.165 11.701 0.021 0.024 <0.001 24 1.233±0.293 1.329±0.143 1.009±0.200 5.518 0.341 0.032 0.001 P1:HtrA高毒力株與UA159標(biāo)準(zhǔn)株比較;P2:UA159標(biāo)準(zhǔn)株與HtrA基因缺陷株比較;P3:HtrA高毒力株與HtrA基因缺陷株比較Ahn et al[11]證實(shí),HtrA在S.mutans的遺傳轉(zhuǎn)化中起著控制生長(zhǎng)和反應(yīng)能力的重要作用。敲除HtrA基因的S.mutans對(duì)承受低溫和高溫,低pH值以及氧化劑和DNA破壞劑的能力降低[5]。HtrA基因的缺失導(dǎo)致S.mutans在37 ℃時(shí)緩慢生長(zhǎng),在42 ℃耐熱性降低[11]。有研究[12]表明HtrA基因的缺失可以限制細(xì)菌的存活能力,在酸性環(huán)境下,HtrA突變體的生長(zhǎng)速度比野生株大大降低。本實(shí)驗(yàn)顯示兩實(shí)驗(yàn)組S.mutans生化鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株S.mutans相符,說(shuō)明了HtrA基因并不會(huì)對(duì)的S.mutans生物學(xué)特性和遺傳特性造成嚴(yán)重影響。而在體外非應(yīng)激條件下,兩實(shí)驗(yàn)組S.mutans菌株的生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)與UA159標(biāo)準(zhǔn)株雖然基本一致,但在4 h以后,HtrA高毒力株組與UA159標(biāo)準(zhǔn)株組的菌液濃度均高于HtrA基因缺陷株組,這說(shuō)明HtrA基因可能并不影響乳牙S.mutans生長(zhǎng)的基本趨勢(shì),但HtrA基因的缺失會(huì)使S.mutans的生長(zhǎng)增殖速度降低。實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡下觀察到各菌株的生物膜:HtrA高毒力株密度最大,HtrA基因缺陷株密度最低,HtrA缺陷株的生物膜較HtrA高毒力株的生物膜顯得粗糙、稀薄,這與結(jié)晶紫染色光鏡下結(jié)果一致,兩者相互印證HtrA基因的缺失可降低S.mutans的黏附,使其形成的生物膜松散、稀薄。細(xì)菌生物膜結(jié)晶紫半定量分析發(fā)現(xiàn)HtrA高毒力株生物膜的形成比HtrA基因缺陷株生物膜的形成快且多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.001),說(shuō)明HtrA基因的缺失會(huì)減緩S.mutans生物膜的形成速度。綜上,HtrA基因與細(xì)菌生長(zhǎng)、應(yīng)激耐受力、反應(yīng)能力和生物膜的形成有關(guān)。Biswas et al[5]認(rèn)為HtrA可能影響S.mutans糖酵解有關(guān)的細(xì)胞外酶從而進(jìn)一步影響S.mutans生物膜的形成能力,本課題組早期研究[13]表明毒力因子GTFs蛋白和基因在乳牙S.mutans HtrA基因缺陷株中的表達(dá)高于HtrA高毒力株,但其生物學(xué)活性低于HtrA高毒力株。證實(shí)了HtrA基因在乳牙S.mutans GTFs的分泌過(guò)程中可有重要的調(diào)控作用,GTFs生物學(xué)活性的降低直接導(dǎo)致了細(xì)胞外葡聚糖的減少,進(jìn)而減緩了S.mutans在牙面的黏附與生物膜的形成。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HtrA對(duì)乳牙變異鏈球菌產(chǎn)酸、黏附的體外研究[J]. 王玲,劉瑤,韓林秀,劉興容.  西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019(06)
[2]HtrA對(duì)乳牙高致齲性變異鏈球菌GTFs表達(dá)及活性的影響[J]. 李政,朱虹倩,謝茹,李菲菲,劉興容.  實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2016(04)



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