牙周病是常見的口腔疾病,在世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率。中間普氏菌（Prevotella intermedia）是一種與牙周病相關(guān)的病原菌,在牙周病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。中間普氏菌能粘附和侵入多種宿主細胞,在這一過程中細菌粘附素及其他致病相關(guān)因子起了很重要的作用。目前該過程的分子機制以及所參與蛋白的功能仍有待進一步的研究。本論文利用中間普氏菌17全基因組序列,應(yīng)用生物信息學(xué)、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)方法來研究中間普氏菌與人上皮細胞相互作用過程中相關(guān)基因和蛋白的功能及其機制。生物信息學(xué)研究中間普氏菌全基因組序列發(fā)現(xiàn)其具有兩個富含亮氨酸重復(fù)序列的潛在粘附素,AdpD和AdpE.分別把編碼這兩個蛋白的基因PI1564和PI1571克隆到pET30a（+）原核表達載體上,并將重組的表達載體轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中誘導(dǎo)AdpD和AdpE融合蛋白的表達。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）分析表明AdpD特異結(jié)合纖維蛋白原,而AdpE特異結(jié)合膠原蛋白。Western印跡表明AdpD和AdpE分布在中間普氏菌細胞外膜上。額外加入的融合蛋白AdpD和AdpE能抑制中間普氏菌粘附到口腔上皮細胞H... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：180 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
目錄
圖目錄
表目錄
縮略語表
1 文獻綜述
    1.1 牙周病
    1.2 口腔細菌
        1.2.1 口腔微生物環(huán)境
        1.2.2 口腔細菌種類及其生境
        1.2.3 牙菌斑
        1.2.4 牙周病原菌
        1.2.5 細菌分泌的致病相關(guān)因子
    1.3 口腔細菌與宿主的相互關(guān)系
        1.3.1 動態(tài)平衡關(guān)系
        1.3.2 牙周病原菌侵入宿主的機制
        1.3.3 細菌外膜蛋白
    1.4 口腔細菌的粘附機制
        1.4.1 研究口腔細菌粘附機制的有利條件
        1.4.2 口腔細菌粘附機制的研究進展
        1.4.3 粘附機制概述
        1.4.4 細菌組成變化
        1.4.5 齦下細菌及細菌共聚
        1.4.6 唾液蛋白和膜上受體
        1.4.7 粘附素
    1.5 中間普氏菌
2 中間普氏菌中一個能結(jié)合纖維蛋白原的蛋白AdpD的鑒定
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試劑和儀器
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 真核細胞的培養(yǎng)
        2.1.4 細菌總DNA提取
        2.1.5 細菌外膜蛋白基因的克隆
        2.1.6 基因原核表達載體的構(gòu)建
        2.1.7 蛋白質(zhì)的原核表達及表達產(chǎn)物的純化
        2.1.8 SDS-PAGE蛋白電泳
        2.1.9 Western印跡分析
        2.1.10 蛋白定量
        2.1.11 多抗血清的制備及純化
        2.1.12 酶聯(lián)免疫吸附法
TM Nickel-HRP檢測His標(biāo)簽的融合蛋白">        2.1.13 HisDetector^TM Nickel-HRP檢測His標(biāo)簽的融合蛋白
        2.1.14 細菌外膜蛋白制備
        2.1.15 檢測真核細胞中的纖維蛋白原
        2.1.16 細菌與上皮細胞粘附實驗
    2.2 結(jié)果分析
        2.2.1 AdpD是一個富亮氨酸的BspA類蛋白
        2.2.2 adpD基因的克隆和原核表達載體構(gòu)建
        2.2.3 利用pET30a（+）載體在大腸桿菌中表達His融合蛋白
        2.2.4 融合蛋白rAdpD的純化
        2.2.5 針對AdpD蛋白的特異性抗體的制備
        2.2.6 AdpD是一個纖維蛋白原結(jié)合蛋白
        2.2.7 AdpD是一個外膜蛋白
        2.2.8 纖維蛋白原在宿主細胞中的分布
        2.2.9 AdpD對中間普氏菌粘附口腔上皮細胞的促進作用
    2.3 討論
3 中間普氏菌中一個能結(jié)合膠原蛋白的蛋白AdpE的鑒定
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 細菌外膜蛋白基因的克隆
        3.1.3 原核表達載體的構(gòu)建和蛋白原核表達
        3.1.4 多抗血清的制備及純化
        3.1.5 SDS-PAGE蛋白電泳和Western印跡分析
TM Nickel-HRP檢測His標(biāo)簽的融合蛋白">        3.1.6 HisDetector^TM Nickel-HRP檢測His標(biāo)簽的融合蛋白
        3.1.7 細菌與上皮細胞粘附實驗
    3.2 結(jié)果分析
        3.2.1 AdpE是一個富亮氨酸的BspA類蛋白
        3.2.2 AdpE的原核表達及純化
        3.2.3 針對AdpE蛋白的特異性抗體的制備
        3.2.4 AdpE是一個膠原蛋白結(jié)合蛋白
        3.2.5 AdpE是一個細菌外膜蛋白
        3.2.6 AdpE對中間普氏菌粘附口腔上皮細胞的促進作用
    3.3 討論
4 應(yīng)用qRT-PCR陣列對中間普氏菌與HeLa細胞相互作用后粘附素基因表達水平的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試劑和儀器
        4.1.2 菌株和真核細胞培養(yǎng)
        4.1.3 侵入實驗及樣品制備
        4.1.4 RNA的提取
        4.1.5 cDNA的合成
        4.1.6 qRT-PCR
        4.1.7 數(shù)據(jù)分析方法
        4.1.8 差異表達基因的克隆和蛋白特性分析
    4.2 結(jié)果分析
        4.2.1 實驗體系的驗證
        4.2.2 PCR擴增效率和引物特異性的分析
        4.2.3 中間普氏菌與HeLa細胞相互作用后的基因表達
        4.2.4 中間普氏菌生長在條件培養(yǎng)液中的基因表達
        4.2.5 基因PIO137生物學(xué)功能鑒定
    4.3 討論
5 中間普氏菌針對HN4和HeLa細胞分泌因子的蛋白表達差異研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試劑和儀器
        5.1.2 在細胞條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)細菌
        5.1.3 細菌外膜蛋白的熒光染色和樣品制備
        5.1.4 細菌全蛋白的提取和制備
        5.1.5 蛋白質(zhì)濃度測定
        5.1.6 等電聚焦
        5.1.7 膠條平衡
        5.1.8 第二維SDS-PAGE電泳
        5.1.9 凝膠染色及圖像分析
        5.1.10 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析
        5.1.11 qRT-PCR檢測差異蛋白對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平
    5.2 結(jié)果分析
        5.2.1 中間普氏菌外膜蛋白的二維凝膠電泳圖譜
        5.2.2 外膜蛋白質(zhì)譜檢測
        5.2.3 編碼差異蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平
        5.2.4 中間普氏菌全蛋白的二維凝膠電泳圖譜
    5.3 討論
        5.3.1 二維凝膠電泳實驗優(yōu)化
        5.3.2 差異蛋白分析
6 全文小結(jié)
參考文獻
附7 不同牙周健康狀況者四種牙周病原菌的檢測水平
    7.1 材料與方法
        7.1.1 技術(shù)方案
        7.1.2 實驗材料和儀器
        7.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)
        7.1.4 臨床檢查和牙周樣品采集
        7.1.5 DNA提取
        7.1.6 實時熒光定量PCR反應(yīng)
        7.1.7 標(biāo)準(zhǔn)定量曲線制備
        7.1.8 統(tǒng)計分析
    7.2 結(jié)果分析
        7.2.1 檢測條件
        7.2.2 不同牙周狀況者四種牙周病原菌的檢出率
        7.2.3 在不同牙周狀況者四種牙周細菌的分布數(shù)量
        7.2.4 細菌在唾液、齦上菌斑和齦下菌斑不同部位分布的相關(guān)性
        7.2.5 四種細菌之間在不同口腔部位分布的相關(guān)性
    7.3 討論
    第7章 參考文獻
附表
作者簡歷



本文編號：3147764