角膜緣干細(xì)胞缺陷癥是臨床上常見的角膜盲的病因,眼表嚴(yán)重的化學(xué)傷及一些免疫性眼表疾病都可導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏,隨之眼表血管化、角膜混濁,進(jìn)而嚴(yán)重影響視力。目前針對(duì)角膜緣干細(xì)胞缺陷癥比較有效的治療方法是自體/異體角膜緣移植或體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植。但對(duì)雙眼角膜緣廣泛損傷的患者,缺乏自體角膜緣干細(xì)胞來(lái)源,而目前臨床應(yīng)用的同種異體角膜移植或角膜緣移植存在著供體篩選、免疫排斥等一系列問(wèn)題,大大影響治療效果。成體干細(xì)胞橫向分化功能的發(fā)現(xiàn),推動(dòng)了多源化組織工程角膜上皮的構(gòu)建,有望成為一種新的治療途徑。選擇合適的自體種子細(xì)胞是目前研究中首要解決的問(wèn)題。角蛋白K3是角膜上皮特異性表達(dá)的蛋白,在口腔黏膜上皮細(xì)胞也有表達(dá),且口腔黏膜取材相對(duì)隱蔽,愈后不留瘢痕等優(yōu)點(diǎn),有望成為組織工程中自體成體干細(xì)胞的一個(gè)新來(lái)源。本研究旨在對(duì)組織工程口腔黏膜的種子細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究,探討最適的種子細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),并對(duì)組織工程口腔黏膜進(jìn)行初步研究,為推進(jìn)未來(lái)組織工程黏膜的研究和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。第一部分兔口腔黏膜上皮細(xì)胞（含干細(xì)胞）的體外培養(yǎng)目的:探討口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法方法:取兔口腔黏膜上皮組織,分別... 

【文章來(lái)源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

倒置顯微鏡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中兔口腔

養(yǎng)后期可見少量細(xì)胞胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，增殖緩慢，細(xì)胞甚至變圓，脫落死亡(圖 1)。第二組中心部位出現(xiàn)復(fù)層，細(xì)胞呈多角形。（圖 2）圖1倒置顯微鏡 上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中兔口腔 圖2 倒置顯微鏡 Defined K-SFM培養(yǎng)中兔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 口腔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線02468101214161 3 5 7 9 11時(shí)間（d)0胞數(shù)（2×1細(xì)4個(gè)/ml）系列1系列2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（表 1）提示：口腔黏膜上皮細(xì)胞傳代接種后第 1-3d 為靜止生長(zhǎng)期，細(xì)胞貼附，增殖緩慢，第 5-10 d 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11 d 后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制，生長(zhǎng)速度減慢。第二組生長(zhǎng)速度較第一組快。三、討 論（一）傳統(tǒng)上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系與無(wú)血清培養(yǎng)體系的比較Rheinwald 首創(chuàng)了小鼠成纖維細(xì)胞 3T3 作為滋養(yǎng)層和含血清培養(yǎng)液的上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法。3T3 細(xì)胞是 Swiss 鼠胚胎成纖維細(xì)胞，3T3 細(xì)胞使用前需經(jīng)射線照射或絲裂霉素 c 處

（一）篩選干細(xì)胞的形態(tài)觀察Ⅳ型膠原黏附純化后的吸附細(xì)胞，胞體較小，形態(tài)較圓，飽滿，折光性強(qiáng)，胞核大，胞質(zhì)少，培養(yǎng)2-3天可見大量細(xì)胞克隆形成（圖3）。圖3 倒置顯微鏡 細(xì)胞克隆形成在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞還表現(xiàn)出一定的分化現(xiàn)象，上皮細(xì)胞克隆在向外擴(kuò)張的同時(shí)，從克隆中心開始出現(xiàn)分化，細(xì)胞表現(xiàn)為復(fù)層，出現(xiàn)時(shí)間約為接種后5d，克隆表層細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞界限不清，開始時(shí)細(xì)胞核清晰，隨著分層的增加，倒置顯微鏡下難以分辨單個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，克隆最外層仍為有增殖能力的單層細(xì)胞。（二）篩選干細(xì)胞相對(duì)特異性蛋白表達(dá)蓋玻片上培養(yǎng)的經(jīng)篩選的口腔黏膜上皮細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示胞核綠色熒光著染，即細(xì)胞核表達(dá)干細(xì)胞相對(duì)特異性P63蛋白，而陰性對(duì)照不著染，細(xì)胞核大，胞質(zhì)較少，呈未成熟細(xì)胞特征。蛋白表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)兩方面均提示所培養(yǎng)細(xì)胞為表皮干細(xì)胞。（圖4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用皮膚干細(xì)胞的橫向分化重建角膜上皮的初步研究[J]. 黃冰,王智崇,葛堅(jiān),陳系古,劉敬波,范志剛,陶靖,劉炳乾,郭芬芬.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2004(10)



本文編號(hào)：3001741