角膜緣干細胞缺陷癥是臨床上常見的角膜盲的病因,眼表嚴重的化學(xué)傷及一些免疫性眼表疾病都可導(dǎo)致角膜緣干細胞缺乏,隨之眼表血管化、角膜混濁,進而嚴重影響視力。目前針對角膜緣干細胞缺陷癥比較有效的治療方法是自體/異體角膜緣移植或體外培養(yǎng)的角膜緣干細胞移植。但對雙眼角膜緣廣泛損傷的患者,缺乏自體角膜緣干細胞來源,而目前臨床應(yīng)用的同種異體角膜移植或角膜緣移植存在著供體篩選、免疫排斥等一系列問題,大大影響治療效果。成體干細胞橫向分化功能的發(fā)現(xiàn),推動了多源化組織工程角膜上皮的構(gòu)建,有望成為一種新的治療途徑。選擇合適的自體種子細胞是目前研究中首要解決的問題。角蛋白K3是角膜上皮特異性表達的蛋白,在口腔黏膜上皮細胞也有表達,且口腔黏膜取材相對隱蔽,愈后不留瘢痕等優(yōu)點,有望成為組織工程中自體成體干細胞的一個新來源。本研究旨在對組織工程口腔黏膜的種子細胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性進行系統(tǒng)研究,探討最適的種子細胞培養(yǎng)技術(shù),并對組織工程口腔黏膜進行初步研究,為推進未來組織工程黏膜的研究和臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。第一部分兔口腔黏膜上皮細胞（含干細胞）的體外培養(yǎng)目的:探討口腔黏膜上皮細胞體外培養(yǎng)方法方法:取兔口腔黏膜上皮組織,分別... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：40 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

倒置顯微鏡上皮細胞培養(yǎng)液中兔口腔

養(yǎng)后期可見少量細胞胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，增殖緩慢，細胞甚至變圓，脫落死亡(圖 1)。第二組中心部位出現(xiàn)復(fù)層，細胞呈多角形。（圖 2）圖1倒置顯微鏡 上皮細胞培養(yǎng)液中兔口腔 圖2 倒置顯微鏡 Defined K-SFM培養(yǎng)中兔黏膜上皮細胞原代培養(yǎng) 口腔黏膜上皮細胞原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞體外培養(yǎng)生長曲線02468101214161 3 5 7 9 11時間（d)0胞數(shù)（2×1細4個/ml）系列1系列2細胞生長曲線（表 1）提示：口腔黏膜上皮細胞傳代接種后第 1-3d 為靜止生長期，細胞貼附，增殖緩慢，第 5-10 d 處于對數(shù)生長期，11 d 后進入平臺期，細胞出現(xiàn)接觸抑制，生長速度減慢。第二組生長速度較第一組快。三、討 論（一）傳統(tǒng)上皮細胞培養(yǎng)體系與無血清培養(yǎng)體系的比較Rheinwald 首創(chuàng)了小鼠成纖維細胞 3T3 作為滋養(yǎng)層和含血清培養(yǎng)液的上皮細胞培養(yǎng)方法。3T3 細胞是 Swiss 鼠胚胎成纖維細胞，3T3 細胞使用前需經(jīng)射線照射或絲裂霉素 c 處

（一）篩選干細胞的形態(tài)觀察Ⅳ型膠原黏附純化后的吸附細胞，胞體較小，形態(tài)較圓，飽滿，折光性強，胞核大，胞質(zhì)少，培養(yǎng)2-3天可見大量細胞克隆形成（圖3）。圖3 倒置顯微鏡 細胞克隆形成在培養(yǎng)過程中細胞還表現(xiàn)出一定的分化現(xiàn)象，上皮細胞克隆在向外擴張的同時，從克隆中心開始出現(xiàn)分化，細胞表現(xiàn)為復(fù)層，出現(xiàn)時間約為接種后5d，克隆表層細胞連接緊密，細胞界限不清，開始時細胞核清晰，隨著分層的增加，倒置顯微鏡下難以分辨單個細胞結(jié)構(gòu)，克隆最外層仍為有增殖能力的單層細胞。（二）篩選干細胞相對特異性蛋白表達蓋玻片上培養(yǎng)的經(jīng)篩選的口腔黏膜上皮細胞免疫細胞化學(xué)檢測顯示胞核綠色熒光著染，即細胞核表達干細胞相對特異性P63蛋白，而陰性對照不著染，細胞核大，胞質(zhì)較少，呈未成熟細胞特征。蛋白表達和細胞形態(tài)兩方面均提示所培養(yǎng)細胞為表皮干細胞。（圖4）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用皮膚干細胞的橫向分化重建角膜上皮的初步研究[J]. 黃冰,王智崇,葛堅,陳系古,劉敬波,范志剛,陶靖,劉炳乾,郭芬芬.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2004(10)



本文編號：3001741