發(fā)布時(shí)間：2021-01-22 22:39

　　目的：本課題擬構(gòu)建靶向人Trb3的shRNA真核表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)Trb3 shRNA的舌鱗狀細(xì)胞株,檢測(cè)其對(duì)靶基因的沉默效果、觀察其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Tca8113增殖和凋亡的影響,并初步探討其機(jī)制。方法：運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶向人Trb3 shRNA載體pSUPER-shTrb3;逆轉(zhuǎn)錄病毒方法建立穩(wěn)定干擾內(nèi)源性Trb3基因的舌鱗癌細(xì)胞株；Western Blot、Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)靶基因Trb3的表達(dá)情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況,Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：酶切及測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了靶向人Trb3基因的shRNA真核表達(dá)載體,利用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法成功建立了穩(wěn)定表達(dá)Trb3 shRNA的舌鱗癌細(xì)胞株,Real-time PCR、Western Blot證實(shí)重組質(zhì)粒組細(xì)胞Trb3 mRNA和蛋白表達(dá)水平相對(duì)于空載體細(xì)胞組顯著下降（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下干擾內(nèi)源性Trb3可促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3、7、cleaved-PARP表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)... 

【文章來(lái)源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒psUPER一sh介h3酶切鑒定M:oL15000Marker:l:PsUPER一vector:2:shTrb3#l:3:shTrb3#2:4:shTrb3#3

GAPDH月...月.，3‘r.卜那1川礴 2..礴3圖SW七 stcrnBlot檢測(cè)各組細(xì)胞Trb3蛋白表達(dá)水平 Ser:Tcas113一ser細(xì)胞;sh#l:TCasll3一sh#3細(xì)胞(P值scr Tcas113一sh#l細(xì)胞 :sh#2:Tcas113一sh#2細(xì)胞;sh#3: vssh#l:0.024;servssh#2:0.015;scrvssh#3:0.038)

擾效果明顯，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。選用干擾效果較好的細(xì)胞 Tcas113一sh#2、 Tcas113·sh#3及對(duì)照細(xì)胞 Tcas113一scr。圖6顯示的是在ERS條件下干擾內(nèi)源性Trb3基因舌鱗癌細(xì)胞的增殖系數(shù)。圖6A為剛被染色的原代細(xì)胞 Tcas113，其熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。細(xì)胞被染色后繼續(xù)培養(yǎng)，隨著細(xì)胞分裂，CFSE被平均分配至子代細(xì)胞中而使細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度減弱。細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，分裂的細(xì)胞越多，平均熒光強(qiáng)度就越弱。該組圖橫坐標(biāo)為細(xì)胞熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的分布圖，可得出細(xì)胞的增殖系數(shù)。細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度越小，增殖系數(shù)越大，表明細(xì)胞增殖越快。該組圖顯示，圖 6B:Tcas113一ser細(xì)胞組細(xì)胞增殖系數(shù)為 12.41;圖6C:干擾腸b3后的 Tcas113-sh#2細(xì)胞組細(xì)胞增殖系數(shù) 31.10;圖6D:干擾腸b3后的 Tcas113一sh#3細(xì)胞組細(xì)胞增殖系數(shù)為30.68，證明在ERS條件下


本文編號(hào)：2994030