本文關(guān)鍵詞：NF-κB抑制劑PDTC對人牙髓干細胞定向分化影響及其分子機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：齲病是被WHO列為當代危害人類健康非傳染性疾病之一。牙齲壞后,牙本質(zhì)小管內(nèi)細菌可導(dǎo)致牙髓組織感染或者發(fā)炎。此時牙髓組織中的可分化為成牙本質(zhì)細胞,成骨細胞,神經(jīng)細胞的多能干細胞--牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)遷移分化成為有功能的成牙本質(zhì)樣細胞(odontoblast-like cells,OBLCs),保護牙髓。研究表明,NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)干細胞分化方面有重要作用,如炎癥因子TNF、IL-17作用于骨髓間充質(zhì)干細胞激活I(lǐng)KK-NF-κB信號通路促進降解β-catenin,進而促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[1];在牙髓干細胞分化方面,我們前期研究證明炎癥微環(huán)境下通過TLR4/My D88/NF-кB信號通路促進炎癥因子表達,PDTC作為NF-κB通路抑制劑,能夠抑制NF-κB參與炎癥環(huán)境下對干細胞分化的調(diào)控作用,減輕炎癥反應(yīng)[2]。吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是一種穩(wěn)定的化合物,氨基甲酸鹽的一種,并且被廣泛用作NF-κB通路的抑制劑,文獻報道,PDTC在干細胞分化中發(fā)揮重要作用,如體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在LPS刺激下,激活NF-κB信號通路,RT-PCR檢測得出炎癥環(huán)境下即LPS處理后的骨髓間充質(zhì)干細胞抗炎因子IL-10和TGF-β3表達升高,當PDTC作用于大鼠間充質(zhì)干細胞后,抗炎因子的表達受到抑制,表明PDTC參與炎癥環(huán)境下細胞的免疫調(diào)節(jié)[3];PDTC阻斷NF-κB通路后下調(diào)Smad信號通路可以促進系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[4];而在脂肪間充質(zhì)干細胞中,PDTC抑制NF-κB通路促進TAZ的表達來抑制脂肪間充質(zhì)干細胞的成骨向分化[5]。那么PDTC對炎癥狀態(tài)下牙髓干細胞分化是否有積極影響以及作用機制還不清楚。本研究通過體內(nèi)、體外實驗研究NF-κB抑制劑PDTC對牙髓干細胞成牙/成骨分化能力的影響,以探討PDTC在牙髓干細胞分化中的作用,對牙髓損傷修復(fù)時h DPSCs定向分化機制有重要意義。主要的研究結(jié)果如下:1.h DPSCs分離、培養(yǎng)和鑒定我們使用組織塊酶消化方法,成功分離培養(yǎng)人牙髓原代細胞,然后應(yīng)用有限稀釋法,分離培養(yǎng)牙髓干細胞,取三代細胞運用流式細胞儀進行細胞表面抗原檢測和鑒定,并且體外分別礦化誘導(dǎo)2周、成脂誘導(dǎo)3周對細胞多向分化能力進行檢測,實驗結(jié)果表明我們分離并培養(yǎng)的牙髓干細胞符合間充質(zhì)干細胞相應(yīng)的分子生物學(xué)特點,證明成功建立了h DPSCs細胞系。2.PDTC對h DPSCs增殖能力的影響配制不同濃度PDTC刺激液,通過MTT實驗檢測不同濃度PDTC刺激液(2-200μmol/L)對h DPSCs增殖能力的影響。結(jié)果表明,200μmol/L PDTC可明顯抑制該細胞的增殖能力,對h DPSCs有毒性作用,而其余2μmol/L、20μmol/L兩組濃度PDTC刺激液與對照組相比,抑制h DPSCs增殖能力,但組間無明顯的差異。3.PDTC對體外二維、三維環(huán)境培養(yǎng)h DPSCs定向分化的影響首先二維培養(yǎng)環(huán)境下用2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液分別礦化誘導(dǎo)h DPSCs2周,通過茜素紅染色及定量實驗表明,與對照組相比20μmol/L PDTC組礦化結(jié)節(jié)表達明顯高于對照組,以上證明20μmol/L PDTC能有效地促進h DPSCs的成牙/成骨分化。其次體外將h DPSCs接種于多孔納米纖維結(jié)構(gòu)明膠復(fù)合支架,為h DPSCs提供三維生長環(huán)境,然后配制濃度為2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,對照組為10%FBS培養(yǎng)液,通過MTT測定刺激組和對照組1、3、5、7天490 nm吸光度值,結(jié)果表明,2μmol/L、20μmol/L PDTC抑制細胞增殖能力;再次,配制2μmol/L、20μmol/L PDTC刺激液,礦化誘導(dǎo)2周,通過茜素紅染色及定量結(jié)果與礦化組比較表明20μmol/L PDTC刺激組促進h DPSCs成骨分化,結(jié)果證明PDTC促進體外三維培養(yǎng)環(huán)境下h DPSCs成牙/成骨分化。4.體內(nèi)裸鼠實驗觀察PDTC對h DPSCs定向分化的影響本實驗通過將預(yù)先用20μmol/L PDTC礦化誘導(dǎo)的h DPSCs接種于納米明膠支架材料,并觀察6周后取材,HE染色、Masson染色、Von Kossa染色、X線平片結(jié)果及Micro-CT三維重建及數(shù)據(jù)分析來觀察PDTC對h DPSCs成牙/成骨向分化的影響,結(jié)果表明,20μmol/L PDTC促進h DPSCs成牙/成骨向分化。5.研究PDTC對h DPSCs定向分化影響機制通過茜素紅染色及定量實驗和Western blot技術(shù),初步探討PDTC調(diào)控h DPSCs定向分化機制。結(jié)果證明PDTC刺激組和對照組比較p-p65蛋白表達降低,表明NF-κB通路參與h DPSCs成牙/成骨分化調(diào)節(jié);ERK通路抑制劑(U0126)明顯抑制PDTC誘導(dǎo)h DPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成,MAPK(JNK、p38)抑制劑(SP600125、SB203580)抑制相應(yīng)通路后,PDTC對h DPSCs成牙/成骨分化作用不受影響,即JNK、p38通路不參與PDTC對h DPSCs成牙/成骨分化。綜上所述,本研究通過體外、體內(nèi)實驗證明一定濃度PDTC能夠抑制h DPSCs增殖,促進h DPSCs的成牙/成骨向分化,并且進一步研究發(fā)現(xiàn)NF-κB負向調(diào)節(jié)PDTC刺激下h DPSCs成牙/成骨分化,ERK通路正向調(diào)節(jié)該過程,為進一步闡明h DPSCs定向分化機制奠定堅實理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：PDTC 人牙髓干細胞 成牙/成骨分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.1
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-23
• 一、牙髓干細胞研究現(xiàn)狀15-17
• 二、NF-κB與干細胞分化17-18
• 三、MAPK與干細胞分化18-19
• 四、PDTC研究現(xiàn)狀19-20
• 五、牙再生組織工程相關(guān)材料研究報道20-23
• 實驗一 人牙髓干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定23-31
• 1 材料23-24
• 2 方法24-27
• 3 結(jié)果27-30
• 4 討論30-31
• 實驗二 PDTC對人牙髓干細胞增殖能力的影響31-35
• 1 材料31-32
• 2 方法32-33
• 3 結(jié)果33-34
• 4 討論34-35
• 實驗三 PDTC對人牙髓干細胞定向分化的影響35-42
• 1 材料35-36
• 2 方法36-37
• 3 結(jié)果37-40
• 4 討論40-42
• 實驗四 體內(nèi)裸鼠實驗觀察PDTC對人牙髓干細胞定向分化的影響42-51
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-48
• 4 討論48-51
• 實驗五 PDTC對人牙髓干細胞定向分化影響的機制研究51-61
• 1 材料51-53
• 2 方法53-55
• 3 結(jié)果55-59
• 4 討論59-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻62-72
• 個人簡歷和研究成果72-73
• 致謝73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王剛;王海燕;梁宏;吉利賓;;LPS對大鼠骨髓MSC NF-κB p65及抗炎性細胞因子mRNA表達的影響[J];青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年03期

2 李琦,于穎彥,朱正綱,劉炳亞,紀玉寶,張軼,陳雪華,林言箴;核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制劑PDTC對胃癌細胞株增殖和凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達影響的實驗研究[J];中國癌癥雜志;2005年01期

3 王志華;呂海鵬;韓冰;張菁;付蕾;張婧;李丹;張芳;何文喜;;NF-κB信號通路在人牙髓細胞分化中作用的研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2013年03期

  本文關(guān)鍵詞：NF-κB抑制劑PDTC對人牙髓干細胞定向分化影響及其分子機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：295465