發(fā)布時(shí)間：2020-11-14 02:40

　　 人涎腺粘液表皮樣癌(Mucoepidermoid Caecinoma,MEC)是涎腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤,約占涎腺惡性腫瘤的30%,盡管有時(shí)表現(xiàn)像良性病變,生長(zhǎng)比較慢,但是該腫瘤有時(shí)是高度惡性而且預(yù)后很差。低分化的涎腺粘液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),5年的存活率不超過(guò)43%。 趨化因子屬于小分子趨化性細(xì)胞因子超家族成員,可通過(guò)與G蛋白耦聯(lián)的受體相互作用,誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重建、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和定向性遷移。趨化因子受體4(Chemokine receptor 4, CXCR4)是一種7次跨膜趨化因子受體,其重要配體是(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1, Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)。CXCR4和SDF-1形成CXCR4/SDF-1生物反應(yīng)軸,在乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、喉癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)作用機(jī)制在于應(yīng)用小的雙鏈RNA引發(fā)序列特異性的基因表達(dá)的“沉默”或“敲除”。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中這種雙鏈RNA可以是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (Small hairpin RNA,shRNA);也可以是3'-端帶有游離堿基的簡(jiǎn)單的二聚體(Small interference RNA, siRNA)。轉(zhuǎn)染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往時(shí)間比較短,而且局限于容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。與siRNA相比,應(yīng)用shRNA獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因干擾更為有效。最近,已有研究報(bào)道應(yīng)用siRNA沉默乳腺癌中CXCR4。 至今為止,尚未見(jiàn)CXCR4/SDF-1生物反應(yīng)軸對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌增殖和轉(zhuǎn)移有調(diào)控作用的相關(guān)報(bào)道。我們推測(cè)CXCR4也可能涎腺粘液表皮樣癌增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中我們選擇了同一來(lái)源的兩種不同增殖和轉(zhuǎn)移能力的涎腺粘液表皮樣癌細(xì)胞系,MEC-1細(xì)胞系和其高轉(zhuǎn)移分離株Mc3細(xì)胞系,檢測(cè)了兩種細(xì)胞系CXCR4的差異表達(dá)以及SDF-1α的表達(dá)情況,成功構(gòu)建CXCR4-shRNA表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Mc3細(xì)胞,阻斷其CXCR4的表達(dá)。并通過(guò)一系列體外、體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)Mc3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性,探討CXCR4對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌可能存在的生物學(xué)效應(yīng)。主要研究方法和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面: 1. CXCR4在人涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá) 人類基因組分類芯片(BioStarH-I)篩選MEC-1細(xì)胞及Mc3細(xì)胞差異表達(dá)基因,選定靶基因CXCR4,用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)CXCR4在MEC-1細(xì)胞和Mc3細(xì)胞中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示CXCR4在Mc3細(xì)胞中高表達(dá),而在兩種細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)SDF-1α的表達(dá),二者無(wú)顯著性差異。 2. CXCR4-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 按照siRNA設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)針對(duì)CXCR4基因的shRNA,構(gòu)建pWH1- CXCR4真核表達(dá)載體,應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Mc3細(xì)胞,600μg/ml G418篩選3周,300μg/ml G418繼續(xù)篩選1周。用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA后CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平被顯著抑制。 3. CXCR4-shRNA抑制Mc3細(xì)胞增殖相關(guān)特性 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、裸鼠頜下腺原位移植瘤等方法,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)受到抑制。實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別為26.5 hr,20.6hr和20.4 hr。CXCR4-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Mc3細(xì)胞軟瓊脂克隆形成抑制率為33.9%;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞S期和G2期細(xì)胞比例下降;裸鼠頜下腺原位移植瘤抑制率為17.1%。 4. CXCR4-shRNA抑制Mc3細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)特性 轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞在Matrigel人工重構(gòu)基底膜上30 min的粘附抑制率21.4%;趨化率和侵襲率分別降低至對(duì)照組的43.8%和52.7%;裸鼠肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率為47.6%。 5. CXCR4-shRNA對(duì)Mc3細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)顯著降低。 結(jié)論: 1. CXCR4在人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系Mc3中高表達(dá)。 2. CXCR4基因沉默可導(dǎo)致Mc3細(xì)胞增殖能力、體外遷移和侵襲能力降低,并能有效抑制Mc3細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移,提示CXCR4與Mc3細(xì)胞的增殖及高轉(zhuǎn)移性有關(guān)。 3. CXCR4可以調(diào)控Mc3細(xì)胞血管VEGF的表達(dá),提示可能調(diào)控該腫瘤的血管生成和微循環(huán)的建立。 4. CXCR4有可能作為涎腺粘液表皮樣癌的惡性度和轉(zhuǎn)移性的表型;預(yù)后評(píng)估的參考;也可能成為其治療的靶基因。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

SDF-1 空間構(gòu)型圖1. 2 趨化因子受體 4 的結(jié)構(gòu)特征CXCR4 為 SDF-1 受體，高度保守，α 螺旋跨膜 7 次，由酸組成，在人體內(nèi)，編碼基因位于人染色體 2q21，有一個(gè)胞個(gè)胞內(nèi)環(huán)，3 個(gè)胞外環(huán)和 1 個(gè)胞內(nèi) C 端，SDF-1 與 CXCR4 的并與 CXCR4 和第二胞外環(huán) ECL2 (second extracelluar loop) 相啟動(dòng)下游信號(hào)通路。

圖 1.5 SDF-1α RT-PCR 電泳結(jié)果圖 1.4 CXCR4 RT-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果* DL2000 (由上至下): 2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp; 100bp；以下同。3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) MEC-1，Mc3 細(xì)胞系中 CXCR4 蛋白的表達(dá)應(yīng)用 ELITE ESP 型流式細(xì)胞儀對(duì)陰性對(duì)照、MEC-1、Mc3 三組熒光值進(jìn)行檢測(cè)，每組檢測(cè) 5000 個(gè)細(xì)胞，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組 CX陽(yáng)性率為 1.5%、MEC-1 細(xì)胞 CXCR4 陽(yáng)性率為 2.3%，而 Mc3 細(xì)胞 CX的陽(yáng)性率達(dá) 10.0%。CXCR4 膜蛋白在 Mc3 細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于MEC-1 細(xì)胞中的表達(dá)（P ＜0.01，Pearson Chi-Square test），見(jiàn)圖 1

圖 1.5 SDF-1α RT-PCR 電泳結(jié)果圖 1.4 CXCR4 RT-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果* DL2000 (由上至下): 2000bp; 1000bp; 750bp; 500bp; 250bp; 100bp；以下同。3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) MEC-1，Mc3 細(xì)胞系中 CXCR4 蛋白的表達(dá)應(yīng)用 ELITE ESP 型流式細(xì)胞儀對(duì)陰性對(duì)照、MEC-1、Mc3 三組熒光值進(jìn)行檢測(cè)，每組檢測(cè) 5000 個(gè)細(xì)胞，結(jié)果顯示陰性對(duì)照組 CX陽(yáng)性率為 1.5%、MEC-1 細(xì)胞 CXCR4 陽(yáng)性率為 2.3%，而 Mc3 細(xì)胞 CX的陽(yáng)性率達(dá) 10.0%。CXCR4 膜蛋白在 Mc3 細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于MEC-1 細(xì)胞中的表達(dá)（P ＜0.01，Pearson Chi-Square test），見(jiàn)圖 1
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本文編號(hào)：2882969