目的:探討X射線對MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞增殖、凋亡和礦化能力的影響,并從自噬角度初步闡述其可能的分子機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,以6MV/min劑量脈沖速率的醫(yī)用直線加速器照射,分組如下:空白對照組、0.25 Gy組、0.5 Gy組、1 Gy組、2 Gy組和4 Gy組。采用MTT法篩選多西環(huán)素(doxycycline,DOX)作用濃度,通過單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法確定DOX抑制自噬現(xiàn)象的作用時(shí)間,篩選多西環(huán)素濃度為2.5nM時(shí)干預(yù)48h對上述分組進(jìn)行自噬抑制。采用MDC染色法觀察X線照射72h后的自噬現(xiàn)象;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖活力;成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)數(shù)量;ALP試劑盒檢測礦化能力;Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞凋亡情況;免疫印跡法檢測蛋白LC3、Atg5、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Runx2的表達(dá)。結(jié)果:平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示各輻照組細(xì)胞增殖活力明顯降低(P0.05),且有劑量依賴性;茜素紅染色和ALP檢測顯示,輻照組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少(P0.05),礦化程度降低,ALP活性降低,且有劑量依賴性;單丹磺酰尸胺(MDC)染色顯示,各實(shí)驗(yàn)組隨著輻照劑量的增加,熒光強(qiáng)度均有增加;Hoechst 33342細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)輻射組在72h后細(xì)胞核凝聚數(shù)量顯著增多,凋亡小體數(shù)目明顯增多;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示輻照組隨著劑量和時(shí)間的增加,細(xì)胞凋亡率上升(P0.05);Western blot檢測顯示Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Caspase3蛋白相對表達(dá)量隨著輻射劑量的增加均明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);p62和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);Runx2的表達(dá)除0.25 Gy外明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。MDC染色結(jié)果顯示加入2.5nM DOX干預(yù)48h后,各輻照組熒光強(qiáng)度基本消失;平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示加DOX組細(xì)胞增殖活力增高(P0.05);茜素紅染色和ALP檢測顯示加DOX組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多(P0.05),ALP活力升高;Hoechst 33342細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)加DOX組48h,凋亡小體數(shù)目增多;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示加DOX組凋亡率增高(P0.05);Western blot檢測Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Bcl-2/Bax蛋白相對表達(dá)量明顯下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);p62在輻射劑量1 Gy-4 Gy時(shí)蛋白表達(dá)量下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Runx2的表達(dá)量均明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Caspase3在輻射劑量2 Gy和4 Gy時(shí)蛋白表達(dá)量上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:X射線可體外誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡;抑制自噬后,凋亡加重,其機(jī)制可能通過激活線粒體釋放凋亡酶激活因子Caspase-3蛋白有關(guān)。X射線可體外抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞的礦化能力;抑制自噬后,可減輕X射線對成骨細(xì)胞礦化能力的損傷,其機(jī)制可能與上調(diào)ALP活力和成骨相關(guān)基因Runx2有關(guān)。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)研究生學(xué)位論文 基于自噬水平研究 X 射線對成骨細(xì)胞的作用2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1 多西環(huán)素作用濃度的篩選采用 MTT 法分別檢測加入不同濃度的多西環(huán)素后 24h、48h、72h MC3T3-E1成骨細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，多西環(huán)素濃度為 2.5nM 時(shí)干預(yù) 24h、48h 后生存率與空白對照組沒有顯著差異（P>0.05），并結(jié)合 MDC 染色發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素在 2.5nM時(shí)抑制自噬48h其抑制效果最好，因此，選取多西環(huán)素的作用濃度為濃度為2.5nM。

圖 2 MDC 染色法觀察單純輻照組和 DOX+輻射組 MC3T3-E1 的自噬情況（。放大倍數(shù) 200×）Fig. 2 MDC staining was used to observe the autophagy of MC3T3-E1 in the irradiation groupand the DOX+ radiation group. (Magnification 200×).2.4.3 單純 X 射線和抑制自噬后對 MC3T3-E1 成骨細(xì)胞增殖活力的影響通過克隆形成實(shí)驗(yàn)，能夠很好的評價(jià)細(xì)胞對射線的敏感性，平板克隆實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后，通過鏡下觀察細(xì)胞數(shù)>50 個(gè)時(shí)算作 個(gè)克隆。結(jié)果顯示，隨著輻射劑量的增加，單純輻照組的克隆形成率逐漸降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。輻照后加入 DOX 抑制自噬后，與單純輻照組相比，除 0.25 Gy 外，同 劑量下抑制自噬后的 MC3T3-E1 的克隆形成率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

圖 3 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察單純輻照組和 DOX+輻射組 MC3T3-E1 的增殖情況。(A) 單純輻照組和 DOX+輻射組的增殖活力比較；(B) 單純輻照組和 DOX+輻射組增殖率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。注：與 Control 組比，##P<0.01，與單純輻照組相比，*P<0.05，**P<0.01Figure 3 Colony formation assay to observe the proliferation of MC3T3-E1 cells irradiated withDOX+radiation alone. (A) Comparison of the proliferation activities of the radiation-only andDOX+ radiation groups; (B) Data statistics of the proliferation rate of the radiation-only and DOX+radiation groups.Note: Compared with Control group, ##P<0.01, compared with radiation alone group, *P<0.05,**P<0.012.4.4 單純 X 射線和抑制自噬后對 MC3T3-E1 成骨細(xì)胞礦化及 ALP能力的影響⑴采用茜素紅染色觀察 X 射線對 MC3T3-E1 成骨細(xì)胞礦化能力的影響，結(jié)果顯示，隨著輻射劑量的增加，其礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；輻照后加入 DOX 抑制自噬后，與單純輻照組相比，輻射劑量 2 Gy 和4 Gy 時(shí)礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）如圖 4A、B、C 所示。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉巧云;沈漢明;夏大靜;;鋅與自噬[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2016年03期

2 馬文科;戴舒惠;羅鵬;楊悅凡;費(fèi)舟;;線粒體自噬的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年06期

3 付婉;董笛;趙穎;;自噬的相關(guān)分子機(jī)制[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2017年05期

4 方聰聰;毛善平;董慧敏;劉寶輝;王舜;;線粒體自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J];卒中與神經(jīng)疾病;2017年02期

5 李旭卉;吳習(xí)習(xí);張凱;羅海霞;李敏;;線粒體自噬與癌癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年09期

6 馬佳麗;侯靜波;;巨噬細(xì)胞自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究進(jìn)展[J];實(shí)用藥物與臨床;2017年08期

7 陳延斌;黃建安;;自噬在呼吸系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀[J];中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2017年06期

8 張安琪;朱莉拉;劉若冰;;自噬在心肌缺血再灌注過程中的研究進(jìn)展[J];人人健康;2016年20期

9 蘇歷銘;;往日[J];當(dāng)代工人(D版);2017年Z2期

10 張卓鵬;;2016年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)解讀與應(yīng)用分析[J];中學(xué)生理科應(yīng)試;2017年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周玉政;自噬和長鏈非編碼RNA MEG3對IGFBPrP1激活肝星狀細(xì)胞的調(diào)控及其機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 盛岳;Rab37調(diào)控細(xì)胞增值及自噬的分子機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2014年

3 靳佳欣;人類胚源腎細(xì)胞（HEK）中自噬相關(guān)基因4對于自噬相關(guān)基因8的作用探討[D];蘭州大學(xué);2016年

4 蒲濤;23kD肝再生增強(qiáng)因子對人腎小管上皮細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

5 于守水;線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬和線粒體自噬的作用[D];青島大學(xué);2017年

6 閆亞韻;Aβ?lián)p傷致PC12細(xì)胞AD模型PS1介導(dǎo)的自噬功能研究[D];吉林大學(xué);2017年

7 姚小曉;Beclin1和ROS依賴的自噬在Bcl-2抑制劑ABT-737誘導(dǎo)的人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG-2/ADM凋亡中的作用機(jī)制[D];吉林大學(xué);2017年

8 尤婷婷;磷酸二酯酶-4抑制劑ROF通過自噬介導(dǎo)對BV-2細(xì)胞NLRP3炎性小體活化的抑制作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

9 蘇華;VPS34乙酰化調(diào)控其脂激酶活性和自噬的啟動(dòng)[D];浙江大學(xué);2016年

10 孫英杰;細(xì)胞自噬在新城疫病毒感染過程中的作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張毓川;自噬負(fù)性調(diào)控CD8~+T淋巴細(xì)胞的活化和功能[D];浙江大學(xué);2018年

2 王靜超;自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2018年

3 郝艷琴;自噬調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能及其機(jī)制研究[D];南昌大學(xué);2018年

4 賴華毅;鼠傷寒沙門氏菌spvB基因?qū)λ拗骷?xì)胞自噬的影響及其分子機(jī)制的研究[D];南昌大學(xué);2018年

5 陳鵬;環(huán)氧合酶2（COX-2）對Cr（Ⅵ）致DF-1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的調(diào)控研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

6 胡旭瑞;基于自噬水平研究X射線對成骨細(xì)胞的作用[D];蘭州大學(xué);2018年

7 周凈;當(dāng)歸有效部位調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬抗動(dòng)脈粥樣硬化研究[D];蘭州大學(xué);2018年

8 劉浪;自噬在輻射誘導(dǎo)小鼠肝損傷中的作用及機(jī)制研究[D];貴州醫(yī)科大學(xué);2018年

9 尚波;同型半胱氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬障礙的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2017年

10 徐志飛;蘇尼替尼誘導(dǎo)p53自噬—溶酶體降解的調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)[D];浙江大學(xué);2016年

本文編號：2882678