1.兔BMSCs細(xì)胞成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 目的:探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中基因表達(dá)模式。方法:抽取兔股骨遠(yuǎn)端骨髓,全骨髓貼壁法培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),用RT-PCR的方法檢測(cè)ALP、OPN、collagen-Ⅰ、bFGF和OC基因的表達(dá),并對(duì)BMSCs表面抗原CD44及ALP活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)后,OPN、、ALP、collagen-Ⅰ、OC、bFGF基因分別于第1、2代細(xì)胞正常表達(dá),BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第一代檢測(cè)抗原CD44陽(yáng)性率達(dá)44.4%,ALP含量增高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)中自原代到第2代逐漸向成骨細(xì)胞分化,成骨細(xì)胞特異性基因順序表達(dá),已具備成骨細(xì)胞特征,此為進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化基因表達(dá)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.bFGF-慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 目的:構(gòu)建攜帶人bFGF基因的慢病毒載體,構(gòu)建攜帶GFP基因的慢病毒載體作為對(duì)照,分別轉(zhuǎn)染成骨方向誘導(dǎo)的BMSCs,鑒定bFGF和GFP基因的表達(dá)。方法:設(shè)計(jì)人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盤組織RNA,用RT-PCR的方法擴(kuò)增出bFGF基因,連接至pLenti6/V5-D-TOPO?表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ雙酶切和DNA測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒正確構(gòu)建。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000的介導(dǎo)下,bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表達(dá)質(zhì)粒同包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、包膜質(zhì)粒pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞株,收集bFGF-慢病毒上清轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后第2代的兔BMSCs。設(shè)計(jì)GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid為模板,PCR的方法擴(kuò)增出GFP基因,連接至pLenti6/V5-D-TOPO?表達(dá)質(zhì)粒,GFP-慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染BMSCs過(guò)程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法檢測(cè)bFGF mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,對(duì)照組BMSCs可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染15天后RT-PCR方法擴(kuò)增出bFGF基因,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的基因片段大小一致。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶人bFGF和GFP基因的真核表達(dá)載體,建立轉(zhuǎn)染兔BMSCs的方法,可作為組織工程骨的種子細(xì)胞用于進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R78
【部分圖文】：

薄的胞質(zhì)突起，細(xì)胞核圓形或橢圓形，有多個(gè)核仁，胞漿中有黑色顆粒。傳代后的BMSCs 生長(zhǎng)較為緩慢（見(jiàn)圖 1-2）。圖1-1 原代BMSCs（×40） 圖1-2 誘導(dǎo)后BMSCs（×40）1.2.2 BMSCs 生長(zhǎng)曲線誘導(dǎo)培養(yǎng)中，接種第 2 天的 BMSCs 數(shù)量少于第 1 天接種時(shí)的數(shù)量，第 2 天到第5 天為增殖期，第五天達(dá)到最高峰，第五天至第八天逐漸減少(見(jiàn)圖 1-3)。

誘導(dǎo)后BMSCs（×40）

圖1-3 BMSCs生長(zhǎng)曲線SCs 增值活力BMSCs 以 1×105/ml 接種于 96 孔板，連續(xù)培養(yǎng) 6 天可見(jiàn)第三天細(xì)胞增殖活躍，第三天到第六天增殖能力逐漸圖1-4 BMSCs MTT值胞標(biāo)志性基因在 mRNA 水平的表達(dá)
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 唐小雪;bFGF基因轉(zhuǎn)染對(duì)羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨調(diào)節(jié)作用的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2881014