目的:明確miR-504對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca-8113中細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、平板克隆和凋亡,進(jìn)行下游靶基因的篩選和驗(yàn)證。探討miR-504在Tca-8113生物學(xué)行為中所發(fā)揮的作用與相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,為深入理解口腔癌發(fā)病分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。方法:(1)本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染人工合成的miR-504模擬物和無關(guān)序列NC來調(diào)節(jié)miR-504在口腔癌細(xì)胞Tca-8113中表達(dá)水平,進(jìn)而研究miR-504在口腔癌細(xì)胞Tca-8113中所起的作用。通過RT-qPCR檢測(cè)miR-504在口腔癌細(xì)胞Tca-8113中表達(dá)水平的差異。以轉(zhuǎn)染無關(guān)序列NC的Tca-8113細(xì)胞作為對(duì)照。(2)上調(diào)miR-504在口腔癌細(xì)胞Tca-8113中的表達(dá)水平,通過口腔癌細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力、平板克隆能力以及細(xì)胞凋亡來評(píng)價(jià)miR-504的作用。(3)通過在線microRNA靶基因預(yù)測(cè)工具(miRanda,Target Scan和miRTarBase)預(yù)測(cè)miR-504的靶基因,雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,Western blotting對(duì)靶基因進(jìn)行檢測(cè)。(4)通過Western blotting和RT-qPCR對(duì)miR-504抑制口腔癌細(xì)胞Tca-8113增殖機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果:(1)RT-qPCR檢測(cè)miR-504的表達(dá),結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-504模擬物后,與NC組相比miR-504的表達(dá)水平顯著提高(P0.01)。(2)上調(diào)口腔癌細(xì)胞miR-504的表達(dá)水平后,與NC組相比細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞侵襲能力、細(xì)胞平板克隆能力顯著被抑制,細(xì)胞凋亡能力無顯著性差異。(3)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-504的靶基因,最終選定CDK6為靶基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)雙熒光報(bào)告基因顯示轉(zhuǎn)染miR-504后構(gòu)建的熒光報(bào)告基因載體Wt CDK6-3'UTR活性明顯降低。(5)Western Blotting結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-504后,CDK6蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。(6)E2F1、Cyclin D1和Beclin 1在miR-504過表達(dá)組較陰性對(duì)照組蛋白表達(dá)量明顯下調(diào),p21在miR-504過表達(dá)組較陰性對(duì)照組蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。結(jié)論:本研究以口腔癌中miR-504的異常表達(dá)為切入點(diǎn),探討miR-504在口腔癌中的作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制,miR-504高表達(dá)抑制口腔癌細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲和平板克隆能力,在口腔癌細(xì)胞中可能扮演著抑癌角色,明確了miR-504與CDK6的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系,可為臨床治療口腔癌提供一種新的思路及理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

注：與對(duì)照組比較*p<0.05，**p<0.01。圖2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-504 mimics后Tca-8113細(xì)胞miR-504 mRNA 表達(dá)變化2.2 miR-504-5p 可抑制口腔癌細(xì)胞增殖表 2.1 調(diào)節(jié) miR-504 表達(dá)水平對(duì) Tca8113 細(xì)胞活力的影響Groups oh 24h 48h 72hControl 0.512±0.060 1.071±0.111 1.924±0.073#2.795±0.041##10nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.766±0.063 1.216±0.065**##1.894±0.094**##50nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.594±0.022 1.088±0.081**##1.597±0.107**##100nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.598±0.008 0.999±0.007**##1.543±0.017**##NC 0.512±0.060 0.790±0.041 1.748±0.094* 2.715±0.156注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與 NC 組比較，#P<0.05，##P<0.01。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-504 mimics 作用于細(xì)胞后，細(xì)胞生別是處理 48h 和 72h。與對(duì)照組相比，miR-504 mimic（P<0.01），說明上調(diào) miR-504 表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，降1 和圖 2.2。2 可以看出，100nM miR-504 Mimics group 轉(zhuǎn)染 48h 后定這一條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表 2.2 調(diào)節(jié) miR-504 表達(dá)水平對(duì) Tca8113 細(xì)胞增殖率的影響ps 24h 增殖率 48h 增殖率 Mimics group 71.52%±12.30% 63.20%±12.50% 6 Mimics group 55.46%±8.20% 56.55%±14.10% 5 Mimics group 55.84%±6.80% 51.92%±6.70% 73.76%±10.10% 90.85%±15.40% 9

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文表 2.3 調(diào)節(jié) miR-504 表達(dá)水平對(duì) Tca8113 細(xì)胞遷移的影響組別 細(xì)胞數(shù) 相對(duì)倍數(shù) 遷移率CON 73.00 10.88 /NC 65.80 8.33 0.90 0.11 90%MI 20.00 3.35**##0.27 0.05 27%注：MI 組與 CON 組相比，**P<0.01；MI 組與 NC 組相比，##P<0.01；NC 組與 CON 組相比，無差異。
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本文編號(hào)：2857389