顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorders, TMD）是口頜面部第四大疾病，由磨牙咬合關(guān)系異常所導致的顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibularjoint, TMJ）異常受力被認為是TMD的可能致病因素之一。骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)為重癥TMD患者的典型病理改變，其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨進行性退變及軟骨下骨改變。目前對TMJOA的病理實質(zhì)和發(fā)病機理的認識還不甚清楚，致使其臨床治療效果不佳。因此，為了深入闡明TMJ OA的發(fā)病機理，有必要建立高度模擬臨床TMJOA發(fā)病過程的仿真動物模型。關(guān)節(jié)軟骨為無血管、無淋巴管的組織，因此長期以來一直被認為是惰性組織、免疫豁免區(qū)。盡管體內(nèi)、外研究均表明軟骨細胞具有一定的遷移、吞噬功能，尚未見到探索吞噬樣軟骨是否表達巨噬細胞特異性標志物的報道，而該細胞在軟骨退變中的作用也不清楚。本研究首先揭示大鼠TMJ髁突增齡性變化特征，為后續(xù)TMJOA動物模型研究提供基線資料；其次以年輕大鼠為研究對象，通過正畸學方法建立不同類型磨牙咬合紊亂，論證磨牙咬合紊亂可作為獨立因素造成大鼠TMJ軟骨OA樣改變；然后通過兩次移動磨牙建立TMJ OA樣變大鼠模型，針對此模型研究OA髁突軟骨及軟骨下骨病變的病理實質(zhì)和發(fā)病機理；最后探索軟骨特異性吞噬細胞的存在及其在OA軟骨退變中的作用，以期為臨床TMJ OA的治療提供新策略。 首先采用大體測量、組織測量術(shù)、Micro-CT等方法探索2-7月齡大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨厚度及軟骨下骨密度及顯微結(jié)構(gòu)的的增齡性特征，為后續(xù)軟骨及軟骨下骨病理學特征研究提供基線資料；據(jù)此結(jié)果，我們選擇8周齡大鼠為研究對象，并以同齡同性別大鼠為對照，采用正畸學方法建立不同磨牙咬合異常模型，即推左上、右下頜第一磨牙（M1）向近中移動組（Exp_I），推左上、右下頜第三磨牙（M3）向遠中移動（Exp_II），推兩下頜M3向遠中移動組（Exp_III），推兩上頜M3向遠中移動（Exp_IV），對照組不進行任何操作，采用HE及甲苯胺藍組織學定量法研究磨牙咬合異常對TMJ髁突軟骨組織形態(tài)的影響；隨后采用以上方法首先造成左上、右下頜M1咬合紊亂，4周后再造成左上、右下頜M3咬合紊亂(雙磨牙咬合紊亂組)，以此建立TMJ髁突OA樣變大鼠模型，通過免疫組化染色、TUNEL原位標記、實時定量PCR等實驗手段探索實驗8、12周后軟骨細胞增殖及死亡平衡在OA軟骨退變中的作用及其信號傳導機制；繼而采用Micro-CT、組織測量術(shù)、成骨動態(tài)標記、TRAP及免疫組化染色等方法探索軟骨細胞異常分泌破骨相關(guān)因子M-CSF、OPG及RANKL在OA軟骨下骨改變中的作用；最后綜合運用體內(nèi)及體外實驗，以雙磨牙咬合紊亂大鼠及其對照組TMJ以及OA患者及外傷截（對照組）肢膝關(guān)節(jié)標本為研究對象，通過透射電鏡、western blot、流式細胞技術(shù)、細胞分選、活細胞工作站等方法探索軟骨特異吞噬細胞在OA軟骨退變中的作用。 實驗結(jié)果： 1．大鼠TMJ髁突顯著增齡性變化主要發(fā)生在2-5月齡，其中軟骨厚度快速降低時間段：雌性為2到3月齡，雄性大鼠為2到4月齡；髁突軟骨下骨密度（BMD）快速增加時間段：雌性為3到4月齡，雄性大鼠為3到5月齡；軟骨下骨骨積極分數(shù)（BV/TV）及骨小梁厚度（Tb.Th）顯著增加，而骨表面積/骨體積（BS/BV）及骨小梁數(shù)量（Tb.N）顯著降低時間段：雌雄性均為3到4月齡。 2．磨牙移動組軟骨局部出現(xiàn)退行性改變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨中、后部成熟層與肥大層局部軟骨間質(zhì)均質(zhì)嗜伊紅染色及局部蛋白多糖丟失。其中雌性Exp_II、 Exp_III及Exp_IV組10個關(guān)節(jié)中分別有7、4及2個出現(xiàn)軟骨退變，而雄性Exp_II、Exp_III及Exp_IV組10個關(guān)節(jié)中分別有2、1及1個出現(xiàn)軟骨退變。對照組及Exp_I組未出現(xiàn)該變化。實驗組典型的增殖性反應主要表現(xiàn)為自軟骨肥大層向軟骨下骨突起的“釘突狀”結(jié)構(gòu)，該區(qū)域內(nèi)細胞排列散亂，原正常軟骨分層結(jié)構(gòu)紊亂，有的表現(xiàn)為肥大層細胞消失，增殖層細胞向下侵入至軟骨下骨，細胞排列散亂；有的則表現(xiàn)為軟骨細胞被細胞外基質(zhì)分割包圍，局部形成“島樣結(jié)構(gòu)”。其中雌性Exp_III及Exp_IV組，雄性Exp_I、Exp_II、Exp_III、Exp_IV組及對照組分別有2、5、2、2、3、1及1個關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨增殖性反應。在雌性，Exp II(P=0.003)及ExpIII(P=0.018)組軟骨退變率均顯著高于對照組，而Exp I及Exp IV組與對照組無顯著差異(P0.05)。Exp II組軟骨退變率明顯高于Exp I及Exp IV組(P 0.05)，而與ExpIII組間無明顯差異(P0.05)。在雄性，各實驗組軟骨退變率均與對照組無明顯差異，且各實驗組間也無明顯差異(P0.05)。此外，雌性Exp II組軟骨退變率明顯高于雄性Exp II組(P=0.012)。 3．雙磨牙咬合紊亂組雌性大鼠髁突軟骨出現(xiàn)明顯退變，主要表現(xiàn)為軟骨表面損蝕樣變，軟骨基質(zhì)出現(xiàn)無結(jié)構(gòu)的均質(zhì)嗜伊紅纖維化及蛋白多糖丟失；軟骨細胞數(shù)目明顯減少，胞核固縮，個別部位軟骨細胞聚集形成獨立的“島樣結(jié)構(gòu)”；軟骨各層結(jié)構(gòu)嚴重紊亂，呈乳突狀突向軟骨下骨，髁突后部軟骨纖維層明顯增生、肥厚，肥大層細胞結(jié)構(gòu)紊亂。 4．雙磨牙咬合紊亂組大鼠髁突軟骨中、后部出現(xiàn)大量胞核固縮、嗜伊紅染色的細胞，電鏡下8周實驗組病變軟骨內(nèi)凋亡細胞明顯增多，其形態(tài)學特征為胞質(zhì)突起消失、周圍染色質(zhì)邊集化及胞內(nèi)形態(tài)不規(guī)則的異染色質(zhì)明顯增多。12周實驗組病變軟骨內(nèi)壞死軟骨細胞明顯增多，呈局灶性聚集。雌性12周實驗組軟骨內(nèi)PCNA陽性細胞較其同齡對照組明顯減少(P 0.05)，其8及12周實驗組軟骨內(nèi)TUNEL及caspase-3陽性細胞均明顯增多(P 0.05)。然而，雄性僅12周實驗組軟骨內(nèi)TUNEL及caspase-3陽性細胞較其同齡對照組減少(P 0.05)，增殖細胞卻未發(fā)生明顯改變(P0.05)。雌性8及12周實驗組caspase-3、caspase-9、MAP4K3、bax/bcl-2mRNA的表達均分別明顯高于其同齡對照組(P 0.05)，而caspase-8及P53的表達在實驗組與對照組間則無明顯差異(P0.05)。 5．雙磨牙咬合紊亂組大鼠髁突軟骨退變及鈣化在實驗8周開始出現(xiàn)，而明顯的軟骨下骨丟失則發(fā)生在實驗12周，其主要特征為較其同齡對照組BMD、BV/TV及Tb.Th下降，但Tb.Sp增加(P 0.05)。伴隨實驗12周時的骨丟失發(fā)生的還有新生骨比率降低、血清CTXs升高及軟骨下骨破骨細胞數(shù)量及面積的增加(P 0.05)，表明實驗12周時軟骨下骨出現(xiàn)骨吸收。在12周實驗組軟骨退變區(qū)域周圍的肥大層內(nèi)，M-CSF、VEGF、RUNX-2及RANKL/OPG陽性細胞面積均較其同齡對照組明顯增加(P 0.05)，這與其mRNA水平變化相一致。此外，12周實驗組RANKL/OPG的水平較8周實驗組明顯升高(P 0.05)。 6．3周齡大鼠TMJ髁突及膝關(guān)節(jié)軟骨增殖層深部及肥大層淺部可見CD163陽性細胞，其分別為從髁突及膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)分選出的Col-II陽性細胞的2.6%及3.3%，其中約70%具有吞噬功能。透射電鏡結(jié)果顯示雙磨牙咬合紊亂組退變軟骨內(nèi)部分吞噬樣軟骨細胞正在吞噬其周邊的凋亡及壞死細胞，且其軟骨內(nèi)CD163、TNF-α及MMPs基因及蛋白水平均較其同齡對照組明顯增高(P 0.05)，但軟骨內(nèi)ACP-1，NO及ROS的量則無明顯差異。8周實驗組及其對照組髁突軟骨中的Col-II陽性細胞CD163表達及吞噬功能檢測結(jié)果顯示，實驗組CD163表達及吞噬功能均較其同齡對照組明顯增高(P 0.05)，同樣，外源性TNF-α也可顯著增加原代軟骨的細胞CD163表達及吞噬功能(P 0.05)。此外，在截肢膝關(guān)節(jié)軟骨（對照組）中幾乎看不到CD163或TNF-α陽性軟骨細胞，而在膝關(guān)節(jié)OA軟骨中CD163及TNF-α陽性細胞數(shù)目明顯增多(P 0.05)。 由此得出以下結(jié)論： 1．大鼠TMJ髁突軟骨及軟骨下骨的增齡性變化主要發(fā)生在5月齡之前，主要表現(xiàn)為軟骨變薄、軟骨下骨骨量增多及骨小梁變厚，本實驗為后續(xù)TMJ髁突軟骨及軟骨下骨病理學特征研究提供基線資料，且后續(xù)實驗中要注意排除增齡性特征對判定結(jié)果的影響。 2．不同類型的磨牙咬合紊亂可造成雌性大鼠TMJ髁突軟骨不同程度的退行性變，其中推左上、右下頜M3向遠中移動所造成的軟骨退變最為明顯。 3．雙磨牙咬合紊亂可以誘發(fā)雌性大鼠髁突軟骨出現(xiàn)明顯OA樣改變，主要表現(xiàn)為軟骨表面損蝕樣變，軟骨基質(zhì)出現(xiàn)無結(jié)構(gòu)的均質(zhì)嗜伊紅纖維化及蛋白多糖丟失,該模型可用于今后TMJOA致病機制的深入研究。 4．雙磨牙咬合紊亂可致雌性大鼠TMJ髁突軟骨出現(xiàn)以細胞增殖減弱及凋亡增加為典型特征的退行性變，由MAP4K3調(diào)控的內(nèi)源性凋亡通路在退變軟骨細胞過度凋亡中發(fā)揮重要作用。 5．雙磨牙咬合紊亂致大鼠髁突軟骨下骨丟失繼發(fā)于軟骨退變之后，而病變軟骨內(nèi)由軟骨細胞異常分泌M-CSF、RANKL等促破骨因子可能在軟骨下骨丟失過程中發(fā)揮重要作用。 6．關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在CD163陽性吞噬細胞，其在退變軟骨內(nèi)數(shù)目增多、吞噬功能增強表明軟骨自身具有清除退變組織的能力。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R782.6
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
Abstract
前言
文獻回顧
實驗一 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨及軟骨下骨增齡特征研究
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4. 結(jié)論
實驗二 不同類型磨牙咬合紊亂對大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨組織形態(tài)的影響
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
實驗三 咬合紊亂致大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突骨關(guān)節(jié)炎樣變動物模型的建立
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
實驗四 咬合紊亂對大鼠 TMJ 髁突軟骨細胞增殖與凋亡能力的影響及凋 亡機制研究
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
實驗五 咬合紊亂對大鼠髁突軟骨下骨的影響
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
實驗六 關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)CD163陽性吞噬細胞的發(fā)現(xiàn)及其在OA退變軟骨中的作用
    1 材料與方法
    2. 結(jié)果
    3 討論
    4 結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻
附錄
個人簡歷和研究成果
致謝

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張旻,王美青,王景杰;絲裂原活化蛋白激酶通路在髁突軟骨細胞力學信號轉(zhuǎn)導過程中的作用[J];上�？谇会t(yī)學;2004年06期

2 元方,王美青,顏朝云,姚秀芳,黃城外;漸進性咬合紊亂導致猴顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的實驗研究初探[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2000年01期

3 陳金武,王美青,劉曉東;漸進性咬合紊亂導致兔髁突退行性變的研究[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2003年02期

本文編號：2855859