發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 23:31

　　 目的：舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它生長(zhǎng)快，浸潤(rùn)強(qiáng)，早期常有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，治療效果不夠理想。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因治療在腫瘤治療中表現(xiàn)出不可估量的作用。 本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113為研究對(duì)象。將克隆的人p27kip1基因連接到pcDNA3載體上，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞。探討其對(duì)人舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞的生物學(xué)作用。 方法：從正常肝組織中，提取組織中的總RNA。應(yīng)用RT-PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照Gene Bank中人p27kip1 cDNA序列，設(shè)計(jì)2個(gè)引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增p27kip1 cDNA。將PCR產(chǎn)物行TA克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后選擇真核表達(dá)載體pcDNA3構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。將pcDNA3-p27kip1和pcDNA3質(zhì)粒DNA分別用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，而后通過(guò)G418培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，應(yīng)用PCR法鑒定p27kip1基因轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞株。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p27kip1蛋白的表達(dá)；凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)；細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。用MTT法檢測(cè)p27kip1基因轉(zhuǎn)染對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；檢測(cè)化療藥物對(duì)p27kip1基因轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 結(jié)果： 1.經(jīng)測(cè)序我們所獲得的p27kip1cDNA與Gene Bank登錄的序列一致為具有完整閱讀框架的p27kip1基因。成功地構(gòu)建了pcDNA3-p27kip1重組表達(dá)質(zhì)粒，pcDNA3-p27kip1重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。篩選出了抗G418陽(yáng)性細(xì)胞克隆，建立二個(gè)新的細(xì)胞株。分別命名為：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-p27kip1的細(xì)胞株為T(mén)ca-P27；轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3的細(xì)胞株為T(mén)ca-P3。應(yīng)用PCR鑒定，pcDNA3-p27kip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞基因組DNA出現(xiàn)p27kip1cDNA擴(kuò)增帶，Tca8113細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3的Tca-P3細(xì)胞基因組DNA的PCR產(chǎn)物為陰性。證明了pcDNA3-p27kip1質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)染入Tca8113細(xì)胞。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)p27kip1蛋白的表達(dá)結(jié)果以p27kip1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。Tca-P27細(xì)胞p27kip1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于Tca-P3、Tca8113細(xì)胞，差異顯著（P0.05）。Tca8113與Tca-P3細(xì)胞p27kip1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異（P0.05）。顯示轉(zhuǎn)染p27kip1基因的 WP=91 Tca8113細(xì)胞獲得了p27kip1蛋白的高表達(dá)。 3.MTT法檢測(cè)Tca8113細(xì)胞、Tca-P3細(xì)胞、Tca-P27細(xì)胞24h(小時(shí))、48h、72h、96h OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，結(jié)果Tca-P27細(xì)胞增殖速度明顯低于Tca8113細(xì)胞和Tca-P3細(xì)胞。24h、48h，Tca-P27細(xì)胞比Tca8113、Tca-P3細(xì)胞增殖速度慢，72h、96h時(shí)，Tca-P27細(xì)胞出現(xiàn)增殖下降。而Tca8113、Tca-P3細(xì)胞在24h、48h、72h、96h呈持續(xù)增殖狀態(tài)，三者增殖速度差異顯著（P0.05）。顯示轉(zhuǎn)染p27kip1基因后抑制了Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)。 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 結(jié)果Tca-P27細(xì)胞G0/G1期占細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于Tca-P3和Tca8113細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，顯著差異（P0.05）。Tca-P27細(xì)胞出現(xiàn)了G0/G1期阻滯。表明轉(zhuǎn)染外源性p27kip1基因在Tca8113細(xì)胞中的高表達(dá)抑制了細(xì)胞周期向S期過(guò)渡，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制了細(xì)胞的增殖。 G2/M和S期所占細(xì)胞百分?jǐn)?shù)Tca-P27細(xì)胞明顯低于Tca8113細(xì)胞和Tca-P3細(xì)胞所占的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（P0.05）。通過(guò)計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)，Tca-P27細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于Tca-P3細(xì)胞和Tca8113細(xì)胞的增殖指數(shù)。三者增殖指數(shù)比較差異顯著（P0.05）。顯示了轉(zhuǎn)染外源性p27kip1基因，使Tca8113細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，細(xì)胞增殖下降，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)。 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果 在G1期前Tca-P27細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡峰，表明Tca-P27細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡。Tca8113細(xì)胞沒(méi)有明顯凋亡峰出現(xiàn)；Tca-P3細(xì)胞也沒(méi)有明顯凋亡峰出現(xiàn)，Tca-P27細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于Tca8113細(xì)胞和Tca-P3細(xì)胞的凋亡指數(shù)，差異顯著（P0.05）。顯示了轉(zhuǎn)染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表達(dá)，誘導(dǎo)了Tca8113細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡。 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果以Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示，Tca-P27細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于Tca8113細(xì)胞和Tca-P3細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，差異顯著（P0.05）。Tca8113細(xì)胞與Tca-P3細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較無(wú)顯著差異（P.05）。顯示了轉(zhuǎn)染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表達(dá)，引起了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)的下調(diào)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，推測(cè)轉(zhuǎn)染外源p27kip1基因誘導(dǎo)了Tca8113細(xì)胞的凋亡，可能與Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 7.用MTT法對(duì)8種化療藥作用Tca-P27細(xì)胞、Tca-P3細(xì)胞、Tca8113細(xì)胞，24h、48h測(cè)OD值計(jì)算化療藥對(duì)三組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果順鉑、絲裂霉素、氟尿嘧啶對(duì)三組細(xì)胞都有明顯的抑制作用。平陽(yáng) 霉素對(duì)三組細(xì)胞有一定的抑制作用，但以上化療藥對(duì)三組細(xì)胞的抑制率比較無(wú)顯著差異（P0.05）均未顯示出轉(zhuǎn)染p27kip1基因有提高以上化療藥對(duì)Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、阿霉素對(duì)三組細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。長(zhǎng)春新堿對(duì)Tca-P27細(xì)胞抑制率明顯高于Tca8113細(xì)胞和Tca-P3細(xì)胞，差異顯著（P0.05）。隨時(shí)間的增加，細(xì)胞抑制率增高（P0.05）。顯示出轉(zhuǎn)染p27kip1基因提高了長(zhǎng)春新堿對(duì)Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。長(zhǎng)春新堿使 WP=92 轉(zhuǎn)染外源p27kip1基因的Tca8113細(xì)胞抑制率增加，推測(cè)可能因長(zhǎng)春新堿作用于M期及其干擾細(xì)胞肌醇磷脂代謝而影響細(xì)胞增殖。同
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：R739.8
【部分圖文】：

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27kip1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建野生型 p27kip1 基因的擴(kuò)增及序列測(cè)定野生型 p27 kip1 基因擴(kuò)增提取的組織中總 RNA 作逆轉(zhuǎn)錄模板，將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以 cDNA 為PCR 擴(kuò)增人 p27kip1cDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳見(jiàn)一約 600bp 的片段，同時(shí)以 比較特異性片段長(zhǎng)度。如圖 1 第 1、2、3 泳道為 PCR 產(chǎn)物，約 600bp 片段，道為分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。1 2 3 4

圖 2 TA 重組質(zhì)粒酶切電泳圖第 1 泳道為標(biāo)尺 λDNA HindⅢ+EcoRI 第 2、3 泳道 p27kip粒（EcoR1+XhoI）酶切片段 第 4、5 泳道為 p27kip1TA 克隆重組6 泳道 DL-2000 Marker經(jīng)酶切鑒定正確，提取人 p27kip1cDNA 重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，Gene Bank 登錄的序列一致，證明我們所獲得的 p27kip1cDNA 為具的 p27kip1 基因，結(jié)果如圖 3、4

人的p27kip1cDNA測(cè)序圖
【參考文獻(xiàn)】

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