發(fā)布時(shí)間：2020-10-15 04:39

　　 背景和目的： 牙周膜又稱牙周韌帶(periodontal ligament,PDL)是一種環(huán)繞牙根,并連接牙根和牙槽骨的致密結(jié)締組織。牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)具有成骨樣細(xì)胞特性,可以分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞。但正常生理狀態(tài)下,牙周膜為堅(jiān)韌和富有彈性的組織,終生不發(fā)生骨質(zhì)化。體外研究發(fā)現(xiàn),牙周膜相關(guān)蛋白-1(periodontal ligament-associated protein-1, PLAP-1)與牙周組織這種保持自身穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡有密切關(guān)系。PLAP-1是通過(guò)研究人牙周膜中活性基因表達(dá)譜系而發(fā)現(xiàn)并定義的。在牙周組織的分化和礦化過(guò)程中,PLAP-1與其他生長(zhǎng)因子之間保持一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)的平衡,防止牙周組織過(guò)度骨質(zhì)化；并且,在骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病機(jī)制中,PLAP-1也是作為一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子,抑制軟骨的形成。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)具有多向分化潛能,根據(jù)不同的誘導(dǎo)條件,該細(xì)胞可分化為各種不同的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與牙周成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后,BMSCs可具有牙周成纖維細(xì)胞的特性。且BMSCs取材簡(jiǎn)便,增殖能力強(qiáng),所以完全可以替代牙周膜成纖維細(xì)胞成為研究牙周組織再生的種子細(xì)胞。 大鼠顱骨臨界骨缺損模型是骨組織工程中評(píng)價(jià)骨修復(fù)效果的經(jīng)典模型,大部分哺乳動(dòng)物的顱、頜面骨在形態(tài)學(xué)和胚胎起源上相似,即顱骨與頜骨均為單一的膜性化骨(下頜骨、蝶骨大翼除外)；在解剖結(jié)構(gòu)上,顱骨與下頜骨均為由2層皮質(zhì)骨內(nèi)夾松質(zhì)骨構(gòu)成；在生理的角度上,顱骨的皮質(zhì)骨和萎縮的下頜骨相似。所以,該模型是理想的下頜骨缺損模型替代者。 鑒于目前對(duì)PLAP-1的研究只局限于體外,本實(shí)驗(yàn)首次嘗試構(gòu)建超表達(dá)PLAP-1的大鼠BMSCs,通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qPCR)技術(shù)鑒定并檢測(cè)成骨標(biāo)志基因的變化,隨后將其移植入Wistar大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損處,八周后觀察PLAP-1對(duì)顱骨修復(fù)效能的影響,以期為進(jìn)一步研究其在牙周組織的穩(wěn)定和牙周炎中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。 材料和方法： 1、超表達(dá)PLAP-1影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究 采用脂質(zhì)體法將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBABE-hygro-PLAP-1,轉(zhuǎn)入293T病毒包裝細(xì)胞,用含有PLAP-1病毒的培養(yǎng)液感染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,采用潮霉素B(Hygromycin B)篩選獲得穩(wěn)定超表達(dá)PLAP-1的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)PLAP-1蛋白和PLAP-1mRNA在大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況,并進(jìn)一步檢測(cè)各個(gè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況,以正常大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作對(duì)照。 2、PLAP-1對(duì)VVistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響 采用牛Ⅰ型膠原制備膠原載體,培養(yǎng)細(xì)胞,并把膠原載體和細(xì)胞共培養(yǎng),制備大鼠顱骨缺損極限骨缺損模型,把膠原載體-細(xì)胞復(fù)合物移植入動(dòng)物顱骨缺損處,于8周時(shí)取材,通過(guò)標(biāo)本大體觀察、X線檢查、軟硬組織切片,HE染色,免疫組織化學(xué)染色,Masson染色,Kossa染色等方法,觀察骨修復(fù)的效果。 結(jié)果： 1、超表達(dá)PLAP-1抑制大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)Hygromycin B篩選成功獲得穩(wěn)定超表達(dá)PLAP-1的BMSCs, RT-qPCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)染pBABE-hygro-PLAP-1后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有PLAP-1的表達(dá),而轉(zhuǎn)染空載體和正常BMSCs中PLAP-1mRNA和蛋白的表達(dá)均為陰性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示各相關(guān)成骨基因表達(dá)量降低。 2、PLAP-1對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響 經(jīng)標(biāo)本大體觀察、X線檢查、石蠟切片和硬組織切片HE染色,免疫組織化學(xué)染色,Masson染色,Kossa染色等方法觀察測(cè)定,以超表達(dá)PLAP-1的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞做種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組大鼠顱骨的修復(fù)效果要差與空白載體組,以及正常細(xì)胞組的修復(fù)效果。 結(jié)論： 1、超表達(dá)PLAP-1可以使大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的各相關(guān)成骨標(biāo)志基因的表達(dá)量降低。 2、超表達(dá)PLAP-1可抑制Wistar大鼠顱骨缺損的骨修復(fù)效果。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R782.2
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞中英文對(duì)照
前言
第一部分 超表達(dá)PLAP-1影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
第二部分 PLAP-1對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：2841706