實驗背景顳下頜骨關節(jié)炎是影響整個關節(jié)的復雜病癥,通過檢查可發(fā)現(xiàn)關節(jié)內骨、軟骨和關節(jié)盤均有退行性改變,并且最終結局之一為關節(jié)軟骨的喪失。白細胞介素-1β是顳下頜骨關節(jié)炎中最重要的細胞因子之一,可通過上調幾種炎癥介質和蛋白水解酶的表達,如MMP-3、MMP-9、MMP-13,因此,阻斷IL-1β或IL-1β誘導的炎癥可能有效地減輕OA的進展。有研究證明,CO能夠抑制細胞凋亡以及炎癥反應等,一氧化碳釋放分子3能夠在生理環(huán)境下可控地釋放CO,模擬生理條件下CO的作用。盡管一氧化碳釋放分子3在抗炎方面研究廣泛,但是其能否對IL-1β引起的軟骨破壞起到保護作用,目前還不十分清楚。目的探究一氧化碳釋放分子3對白介素-1β誘導的髁突軟骨細胞的基質金屬蛋白酶表達的調控作用及其作用機制。材料與方法采用3-4周齡的雄性Wistar大鼠體外培養(yǎng)制備髁突軟骨細胞,應用顯微鏡觀察其體外培養(yǎng)情況,并用細胞形態(tài)學方法和甲苯胺藍染色法,以鑒定分離、培養(yǎng)的細胞為髁突軟骨細胞。通過細胞增殖實驗測定不同濃度(0、100、200、400、800μM)CORM-3對髁突軟骨細胞的毒性作用。運用實時定量PCR檢測0、5、10、20ng/ml的IL-1β刺激24h后各組細胞中MMP-3、9、13的mRNA表達量。根據(jù)結果選用1Ong/ml作為IL-1β的后續(xù)實驗濃度。用qRT-PCR、Western Blot法檢測200μM CORM-3對IL-1β誘導的髁突軟骨細胞MMP-3、9、13 mRNA和蛋白表達的影響。運用Western Blot法檢測10ng/ml IL-1β3刺激細胞5min、10min、30min后細胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表達量,根據(jù)結果選用1Omin作為后續(xù)實驗MAPK通路激活的時間。用Western Blot法檢測CORM-3、SP600125、SB203580、U0126對IL-1β誘導的髁突軟骨細胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的蛋白表達量及MMP-3、9、13的mRNA表達量和蛋白表達量的作用。結果(1)原代培養(yǎng)的大鼠髁突軟骨細胞貼壁生長,細胞不均勻分布,呈多角形,類圓形細胞較少,形態(tài)欠規(guī)則;細胞生長至第8天左右,出現(xiàn)“鋪路石樣”特征;甲苯胺藍染色,培養(yǎng)細胞呈異染性,證明培養(yǎng)的細胞為髁突軟骨細胞;(2)細胞增殖實驗表明200μM的CORM-3對髁突軟骨細胞無明顯細胞毒性;(3)10ng/ml IL-1β可顯著增強大鼠髁突軟骨細胞MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達;(4)200μM的CORM-3可顯著抑制IL-1β誘導的大鼠髁突軟骨細胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 的表達。(5)1Ong/ml IL-1β在1Omin時顯著激活MAPKs信號通路。(6)2000μM CORM-3可顯著抑制P38、ERK信號通路的激活。結論CORM-3通過抑制P38、ERK信號通路來顯著下調IL-1β誘導的髁突軟骨細胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的表達,為顳下頜骨關節(jié)炎的治療提供了新的思路。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R782.6
【部分圖文】：

逡逑圖１－１．大鼠髁突軟骨細胞的分離培養(yǎng)Ａ．原代培養(yǎng)大鼠髁突軟骨細胞；Ｂ．細胞形態(tài)多呈多逡逑邊形；Ｃ．細胞出現(xiàn)“鋪路石樣”改變。逡逑２．髁突軟骨細胞的甲苯胺藍染色的鑒定逡逑第二代軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染色后，可見單層細胞生長區(qū)內，細胞質與細胞逡逑外基質呈紫蘭色，細胞核大而圓，呈深藍色，細胞呈多邊形，據(jù)此鑒定分離的細逡逑胞為軟骨細胞（圖１－２）。逡逑－逡逑圖１－２．經(jīng)甲苯胺藍染色鑒定的軟骨細胞（ｘｉｏｏ），細胞核呈深藍色，細胞質及逡逑細胞外基質呈紫蘭色。逡逑討論逡逑關節(jié)軟骨是一種不同尋常的組織，缺乏自我修復能力，軟骨細胞含量較少，逡逑細胞外基質較多，其基質的特性主導其功能和生物學特性［３Ｇ］。本實驗采用序貫逡逑酶消法獲得了純度較高的大鼠髁突軟骨細胞。形態(tài)學觀察結果發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細逡逑胞在體內和體外環(huán)境的差異，細胞表型并不能長久地保持一致，在３代以前生長逡逑良好

第二代軟骨細胞經(jīng)甲苯胺藍染色后，可見單層細胞生長區(qū)內，細胞質與細胞逡逑外基質呈紫蘭色，細胞核大而圓，呈深藍色，細胞呈多邊形，據(jù)此鑒定分離的細逡逑胞為軟骨細胞（圖１－２）。逡逑－逡逑圖１－２．經(jīng)甲苯胺藍染色鑒定的軟骨細胞（ｘｉｏｏ），細胞核呈深藍色，細胞質及逡逑細胞外基質呈紫蘭色。逡逑討論逡逑關節(jié)軟骨是一種不同尋常的組織，缺乏自我修復能力，軟骨細胞含量較少，逡逑細胞外基質較多，其基質的特性主導其功能和生物學特性［３Ｇ］。本實驗采用序貫逡逑酶消法獲得了純度較高的大鼠髁突軟骨細胞。形態(tài)學觀察結果發(fā)現(xiàn)，由于軟骨細逡逑胞在體內和體外環(huán)境的差異，細胞表型并不能長久地保持一致，在３代以前生長逡逑良好，在３代以后出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，細胞形態(tài)由多角形逐漸變?yōu)殚L梭形，細胞的逡逑這種特質提示我們在三代以內的細胞可能是適合作為實驗研宄的細胞，為進一步逡逑研究大鼠髁突軟骨細胞的其他的生物學特性和顳下頜骨

山東大學碩士學位論文計學意義。逡逑結果逡逑鼠髁突軟骨細胞的毒性作用逡逑，ＣＯＲＭ－３濃度在１００？４００＾Ｍ之間對髁突軟骨＾ｉＭＣＯＲＭ－３有促進細胞增殖的作用，吸光度（Ｐ＜0．0５）。ＣＯＲＭ－３濃度在４０0ｈＭ時大鼠髁８００ｆｉＭ邋ＣＯＲＭ－３組可抑制大鼠髁突軟骨細胞的００ｐＭＣＯＲＭ－３作為實驗濃度進行后續(xù)實驗。逡逑０．８－．逡逑

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本文編號：2832533