目的:沉默體外培養(yǎng)的小鼠腭胚突間充質(zhì)(Embryonic Palate Mesenchymal,EPM)細(xì)胞的Sp8基因,檢測(cè)Shh、Wnt信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)因子的表達(dá),探討Sp8是否參與調(diào)控Shh、Wnt通路相關(guān)信號(hào)因子的表達(dá)及傳遞。方法:1.采用安死術(shù)處死胚胎13.5天的C57BL/6J孕鼠,無菌條件下取出胚胎,分離獲取腭胚突間充質(zhì)組織,酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞,免疫組化染色法進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)鑒定。2.梯度實(shí)驗(yàn)測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)值,利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默第3代EPM細(xì)胞的Sp8基因,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR選擇Sp8基因沉默最佳慢病毒靶點(diǎn)。3.將EPM細(xì)胞分為三組:LV-Sp8-RNAi實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照病毒組、空白對(duì)照組,用Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)PTCH1(Patched1)、GLI3、WNT3A、β-catenin蛋白的表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1.酶消化法獲取的EPM細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)細(xì)胞純度較高,細(xì)胞呈梭形、多角形貼壁生長(zhǎng);免疫組化染色法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為EPM細(xì)胞。EPM細(xì)胞抗波形蛋白(Anti-Vimentin antibody)陽性;抗角蛋白(Anti-pan Cytokeratin antibody)陰性。2.倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后72h的EPM細(xì)胞,在MOI=40時(shí)熒光表達(dá)量約80%左右;RT-PCR選擇Sp8基因沉默最佳慢病毒靶點(diǎn)為L(zhǎng)V-Sp8-RNAi2號(hào)靶點(diǎn),該靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)組細(xì)胞的Sp8m RNA相對(duì)表達(dá)量最低(P0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.Western Blot結(jié)果顯示與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比,LV-Sp8-RNAi實(shí)驗(yàn)組的WNT3A、β-Catenin表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),GLI3表達(dá)水平略有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),PTCH1表達(dá)水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.C57BL/6J胎鼠EPM細(xì)胞中Sp8基因沉默后可導(dǎo)致WNT3A、β-catenin相對(duì)表達(dá)量顯著降低,推斷Sp8基因參與調(diào)控小鼠EPM細(xì)胞中的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路。2.Sp8基因沉默后引起PTCH1相對(duì)表達(dá)量明顯升高、GLI3相對(duì)表達(dá)量降低,推斷Sp8基因參與調(diào)控小鼠EPM細(xì)胞中的Shh信號(hào)傳導(dǎo)通路。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R782.2
【部分圖文】：

圖 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5注：圖 1A 為 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，圖 1B 中黑色箭頭所指為腭板，P 代表腭板e(cuò):Figure.1Ais an Ed 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indicates the palate, P:Palate2 腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。BA

圖 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，圖 1B 中黑色箭頭所指為腭板， 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indi質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。A1.5mm

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 程忠委2.1.3 腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞鑒定顯微鏡下觀察 EPM 細(xì)胞免疫組化染色，根據(jù)染色鑒定結(jié)果可知該細(xì)胞具有間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出該細(xì)胞陽性百分比為(96.35±2.15)%；結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和染色結(jié)果可認(rèn)為該細(xì)胞為小鼠 EPM 細(xì)胞。

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