目的:沉默體外培養(yǎng)的小鼠腭胚突間充質(zhì)(Embryonic Palate Mesenchymal,EPM)細胞的Sp8基因,檢測Shh、Wnt信號通路相關(guān)信號因子的表達,探討Sp8是否參與調(diào)控Shh、Wnt通路相關(guān)信號因子的表達及傳遞。方法:1.采用安死術(shù)處死胚胎13.5天的C57BL/6J孕鼠,無菌條件下取出胚胎,分離獲取腭胚突間充質(zhì)組織,酶消化法培養(yǎng)細胞,免疫組化染色法進行細胞生物學鑒定。2.梯度實驗測定最佳感染復數(shù)(Multiplicity of Infection,MOI)值,利用慢病毒介導的RNAi技術(shù)沉默第3代EPM細胞的Sp8基因,倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR選擇Sp8基因沉默最佳慢病毒靶點。3.將EPM細胞分為三組:LV-Sp8-RNAi實驗組、陰性對照病毒組、空白對照組,用Western Blot技術(shù)分別檢測PTCH1(Patched1)、GLI3、WNT3A、β-catenin蛋白的表達水平,并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果:1.酶消化法獲取的EPM細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至第3代時細胞純度較高,細胞呈梭形、多角形貼壁生長;免疫組化染色法鑒定所培養(yǎng)的細胞為EPM細胞。EPM細胞抗波形蛋白(Anti-Vimentin antibody)陽性;抗角蛋白(Anti-pan Cytokeratin antibody)陰性。2.倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后72h的EPM細胞,在MOI=40時熒光表達量約80%左右;RT-PCR選擇Sp8基因沉默最佳慢病毒靶點為LV-Sp8-RNAi2號靶點,該靶點對應(yīng)組細胞的Sp8m RNA相對表達量最低(P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。3.Western Blot結(jié)果顯示與空白對照組、陰性對照組相比,LV-Sp8-RNAi實驗組的WNT3A、β-Catenin表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),GLI3表達水平略有降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),PTCH1表達水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結(jié)論:1.C57BL/6J胎鼠EPM細胞中Sp8基因沉默后可導致WNT3A、β-catenin相對表達量顯著降低,推斷Sp8基因參與調(diào)控小鼠EPM細胞中的Wnt信號傳導通路。2.Sp8基因沉默后引起PTCH1相對表達量明顯升高、GLI3相對表達量降低,推斷Sp8基因參與調(diào)控小鼠EPM細胞中的Shh信號傳導通路。
【學位單位】：遵義醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R782.2
【部分圖文】：

圖 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5注：圖 1A 為 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，圖 1B 中黑色箭頭所指為腭板，P 代表腭板e:Figure.1Ais an Ed 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indicates the palate, P:Palate2 腭胚突間充質(zhì)細胞的培養(yǎng)置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。BA

圖 1 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎Fig. 1 The C57BL6J mouse embryo of ED13.5 ED13.5 天 C57BL6J 小鼠胚胎，圖 1B 中黑色箭頭所指為腭板， 13.5 C57BL6J mouse embryo, and the black arrow in Fig. 1B indi質(zhì)細胞的培養(yǎng)觀察細胞生長情況。A1.5mm

遵義醫(yī)科大學碩士學位論文 程忠委2.1.3 腭胚突間充質(zhì)細胞鑒定顯微鏡下觀察 EPM 細胞免疫組化染色，根據(jù)染色鑒定結(jié)果可知該細胞具有間充質(zhì)細胞生物學特性，通過統(tǒng)計學分析得出該細胞陽性百分比為(96.35±2.15)%；結(jié)合細胞形態(tài)學觀察和染色結(jié)果可認為該細胞為小鼠 EPM 細胞。

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