Periostin又稱(chēng)為成骨細(xì)胞特異性因子2（osteoblast-specific factor 2， OSF-2），是近幾年來(lái)新確定的一種骨粘附分子，其分于量約90kDa，主要 由成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞所分泌產(chǎn)生，可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附和伸展， 并特異地表達(dá)于骨膜和牙周膜組織，在骨及牙齒的形成過(guò)程中可能起著獨(dú) 特的作用。目前，學(xué)者們己從小鼠和人的cDNA文庫(kù)中克隆到Periostin基 因，該基因與昆蟲(chóng)胚胎的中樞神經(jīng)系統(tǒng)粘附分子fasciclinⅠ屬同一家族，結(jié) 構(gòu)中均含有4個(gè)相似的重復(fù)序列，且其主要功能均為細(xì)胞粘附作用。但 Periostin作為成骨細(xì)胞特異表達(dá)的分子，其在礦化組織形成中的作用尚不十 分清楚，而有關(guān)這方面的研究正逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注。本課題為了對(duì) Periostin的結(jié)構(gòu)與功能有更深入的認(rèn)識(shí)，采用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)小鼠 Periostin C端cDNA進(jìn)行了克隆，原核表達(dá)和純化，并制備了抗Periostin 抗體，進(jìn)行了蛋白印跡（Western blot）和免疫組化的研究，從蛋白和分子 水平探討了Periostin的組織表達(dá)特異性，同時(shí)利用所獲得的具有活性的 Periostin，研究了其對(duì)牙周膜細(xì)胞的一系列生物學(xué)效應(yīng)，為今后進(jìn)一步研究 其生理功能和用于臨床奠定了基礎(chǔ)。本研究分為以下4部分： 一、小鼠Periostin C端編碼區(qū)cDNA克隆及其序列分析 采用異硫氰酸胍一步法從成年昆明小鼠牙周組織中抽提總RNA，用 Oligo(dt)作引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用PCR技術(shù)，從cDNA中擴(kuò)增 出小鼠Periostin C末端編碼區(qū)的基因片段（約940bp），將所得基因片段插 入pRSET-B載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)克隆，提取質(zhì)粒 DNA，通過(guò)限制性酶切和核苷酸序列分析鑒定陽(yáng)性克隆。結(jié)果表明：重組 第凹軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論義 一 質(zhì)粒pRSETE干eriostin的酶切圖譜和序列分析結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的序列 一致。 二、小鼠互組Perinstin C端膚在大腸桿菌中的表達(dá)及活性鑒定 將編碼小鼠 Periostin C端肽的基因片段克隆到大腸桿菌表達(dá)載體 —”””——”————”’—””一’——～’ 一 盡 pRSETS上，使其受控于 T7啟動(dòng)于，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pRS七Ieriostin，以 大腸桿菌 E．COlt BL21（DE3）為宿主菌。對(duì)工程菌用異丙基硫代一p—D一半 乳糖苦（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后進(jìn)行復(fù)性處理，再通過(guò)觀察成 骨細(xì)胞的粘附性和伸展性檢測(cè)其生物學(xué)活性。結(jié)果顯示：經(jīng)IP＊G誘導(dǎo)sh， 工程菌在SDS．PAGE上出現(xiàn)一條新蛋白帶，分子質(zhì)量與預(yù)期的一致約為 36kDa，主要以包涵體形式存在，所得包涵體經(jīng)純化和復(fù)性處理，得到純度 高于 95％的小鼠重組 Periostin C端肽。 為檢測(cè)重組Periostin的活性，采用固相結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)以及四陛鹽比色 （MTT法）等細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，觀察成骨細(xì)胞在 Periostin基質(zhì)上的粘附能 力和伸展率。結(jié)果表明：成骨細(xì)胞在Perio悅in基質(zhì)上的粘附和伸展良好， 當(dāng)濃度在20m勿L以上時(shí)，作用尤其顯著（P＜0．01），與在纖維結(jié)合蛋白（FN） 基質(zhì)上生長(zhǎng)相似。即小鼠重組Periostin可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附和伸展。 三、抗Pertostin抗體的制合和組織裹達(dá)特異性研究 以重組、純化的小鼠Periostin為抗原，混入弗氏完全佐劑充分乳化后， 免疫新西蘭大白兔：用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，將獲得的多克隆 抗血清初步純化后，用Western blot和免疫組化檢測(cè)小鼠Periostin的組織表 達(dá)特異性。Western blot顯示：在小鼠顱蓋骨及牙周組織總蛋白中有特異性 表達(dá)，而在肝、腎和腦組織總蛋白中沒(méi)有表達(dá)。免疫組化檢測(cè)，下頜骨表 面骨膜和牙周膜組織中的Periostin染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，而在牙骨質(zhì)、牙本質(zhì)、 第4頁(yè) 共98頁(yè) 第＊軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論義 一 牙槽骨和牙髓組織中則為陰性，提示Periostin在這兩種組織中的高水平表 4。 四、Periostin對(duì)人牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)作用 1．為了了解小鼠重組 Periostin對(duì)牙周膜細(xì)胞（PDL細(xì)胞）粘附、伸展 及移動(dòng)的影響，我們采用了固相結(jié)合分析以及細(xì)胞機(jī)械創(chuàng)傷模型等方法， 0＿＿＿、＿、＿ 觀察PDL細(xì)胞在Periostin基質(zhì)上的粘附率。伸展率及其定向移動(dòng)的能力。 結(jié)果顯示：Periostin可促進(jìn)PDL細(xì)胞的粘附、伸展和移動(dòng)，且當(dāng)濃度在40 mg幾時(shí)，作用最為顯著。 2．應(yīng)用Mry比色試驗(yàn)及酶動(dòng)力學(xué)方法，測(cè)定了小鼠重組Periostin對(duì) PDL細(xì)胞的增殖和 ALP活性的作用。觀察到 Periostin僅在濃度為 40mg／L 時(shí)，可顯著促進(jìn)PDL 細(xì)胞的增殖，其余濃度則無(wú)作用，而其濃度在 10mg幾－80mg幾范圍中時(shí)，均可顯著提高 PDL細(xì)胞 ALP活性水平，說(shuō)明 小鼠重組Periostin對(duì)PDL
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類(lèi)】：R781.02

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本文編號(hào)：2809695