目的:建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,并植入純HA-TCP支架材料與含種子細胞的HA-TCP支架材料,觀察SD大鼠顱骨缺損組織的愈合情況、新生骨組織結(jié)構(gòu)和骨密度的變化以及骨重建微環(huán)境中ALP、Col-I的表達以及Runx2、OCN的轉(zhuǎn)錄水平,初步研究BMSCs和HUVECs復(fù)合HA-TCP支架共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)SD大鼠顱骨大面積缺損時的成骨能力,為探討修復(fù)口腔頜面部臨界骨缺損的治療方法奠定前期研究基礎(chǔ)。方法:建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,根據(jù)植入支架材料的種類隨機將實驗對象分為4組:(1)A組為空白對照組,即只植入HA-TCP支架;(2)B組為共培養(yǎng)組,即植入BMSCs+HUVECs+HA-TCP支架;(3)C組為骨髓間充質(zhì)干細胞組,即植入BMSCs+HA-TCP支架;(4)D組為臍靜脈內(nèi)皮細胞組,即植入HUVECs+HA-TCP支架。分別于術(shù)后4周、8周、12周通過Micro-CT掃描觀察組織工程骨修復(fù)大鼠顱骨缺損組織的形態(tài)、骨質(zhì)骨量的動態(tài)變化。并取相應(yīng)批次大鼠的支架材料及其周圍組織樣本,通過HE和Masson染色觀察不同時間點復(fù)合支架組織工程骨修復(fù)大鼠顱骨缺損愈合過程中組織形態(tài)和組成的變化,通過免疫組織化學(xué)染色觀察不同時間點復(fù)合支架組織工程骨修復(fù)大鼠顱骨缺損愈合過程中Col-I的分布,并使用image-pro-plus 6.0圖像軟件量化免疫組織化學(xué)切片中Col-I的表達,通過ALP活性試劑盒檢測愈合過程中新生骨組織中ALP活性,通過qPCR檢測愈合過程中新生骨組織中Runx2和OCN的轉(zhuǎn)錄水平的動態(tài)變化。使用SPSS16.0軟件統(tǒng)計處理分析數(shù)據(jù),單因素方差分析比較各組間差異以及Tukey HSD檢驗差異的統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:本實驗成功建立了SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,成功率為98%。Micro-CT掃描分析結(jié)果顯示B組骨痂形成速度最快,骨密度值顯著高于C組和D組,A組骨組織愈合最慢,且骨密度值最低(P0.05),各組骨密度值均隨時間增加而增高,而B組骨密度值上升速度最快;HE和Masson染色結(jié)果顯示:與A組、C組、D組比較,B組三維空間逐漸被新生骨代替,支架材料周圍分布較多排列不規(guī)則、較厚的骨小梁,支架材料內(nèi)部長入較多的新生血管,B組骨痂成熟速度最快;Col-I免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,術(shù)后第4、8、12周時A組Col-I基質(zhì)染色陽性面積均較小,顏色較淺,B組Col-I染色陽性基質(zhì)面積最大,染色最深,平均光密度值最高,與C組和D組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而隨時間增加各組Col-I免疫反應(yīng)陽性染色面積略下降;ALP蛋白活性結(jié)果顯示,B組ALP的表達量隨時間增加而升高,12周時達到高峰,C組和D組8周時上升較多,12周時趨于平緩下降,A組各時間段呈緩慢上升趨勢,B組ALP蛋白活性均顯著高于A組、C組和D組(P0.05);qPCR檢測Runx2和OCN的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示,B組可有效促進骨重建微環(huán)境中Runx2和OCN的轉(zhuǎn)錄水平,其促進效果優(yōu)于A組、C組和D組。結(jié)論:通過建立SD大鼠顱骨臨界缺損模型并植入含或不含種子細胞的HA-TCP支架材料。觀察大鼠顱骨缺損組織結(jié)構(gòu)的變化、新生骨組織中ALP活力的變化、Col-I的表達、Runx2和OCN的轉(zhuǎn)錄水平的變化,探討復(fù)合支架技術(shù)構(gòu)建的組織工程骨對大鼠顱骨缺損修復(fù)的效果,現(xiàn)得到結(jié)論如下:BMSCs和HUVECs復(fù)合HA-TCP共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨能加速愈合骨痂形成、增加新生骨組織密度、獲得良好的骨組織的生長;能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化,促進骨重建微環(huán)境中ALP、Col-I的表達以及Runx2、OCN的轉(zhuǎn)錄水平;可能誘導(dǎo)復(fù)合支架材料內(nèi)部新生血管的形成;能成功修復(fù)大鼠顱骨臨界骨缺損。
【學(xué)位單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【分類號】：R782
【圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié) 果 動物模型建立情況通過建立SD大鼠顱骨缺損模型，植入復(fù)合支架技術(shù)構(gòu)建的組織工程察組織工程骨修復(fù)大鼠顱骨缺損組織愈合的情況。.1 復(fù)合支架組織工程骨的制作情況.1.1 倒置相差顯微鏡下 SD 大鼠原代 BMSCs 的形態(tài)觀察SD 大鼠原代 BMSCs 分離培養(yǎng) 3 天后（圖 1），可見樹突狀、三角形形細胞貼壁生長，且細胞有多個長短不一的突起，細胞核明顯，細富，培養(yǎng) 7 天后可見細胞鋪至瓶底約 90%，準備傳代培養(yǎng) (圖 2)。

西 南 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié) 果 動物模型建立情況通過建立SD大鼠顱骨缺損模型，植入復(fù)合支架技術(shù)構(gòu)建的組織工程察組織工程骨修復(fù)大鼠顱骨缺損組織愈合的情況。.1 復(fù)合支架組織工程骨的制作情況.1.1 倒置相差顯微鏡下 SD 大鼠原代 BMSCs 的形態(tài)觀察SD 大鼠原代 BMSCs 分離培養(yǎng) 3 天后（圖 1），可見樹突狀、三角形形細胞貼壁生長，且細胞有多個長短不一的突起，細胞核明顯，細富，培養(yǎng) 7 天后可見細胞鋪至瓶底約 90%，準備傳代培養(yǎng) (圖 2)。

圖 3 HUVECs 培養(yǎng)第 3 天（40×） 圖 4 HUVECs 培養(yǎng)第 7 天（40×）igure 3 the 3rd days culture of HUVECs (40×) Figure 4 the 7th days culture of HUVECs (40×).1.3 倒置相差顯微鏡下共培養(yǎng)細胞的形態(tài)取第 3 代 BMSCs 和 HUVECs 共培養(yǎng)形態(tài)如圖 5 和圖 6，可見梭形UVECs 和三角形、多角形及樹突狀的 BMSCs，共培養(yǎng) 5 天后可見 BMS滿培養(yǎng)瓶底，0.25%胰蛋白酶消化，將兩種細胞接種于 HA-TCP 支架共培養(yǎng) 7 天后做的掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）。

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本文編號：2807322