目的:建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,并植入純HA-TCP支架材料與含種子細胞的HA-TCP支架材料,觀察SD大鼠顱骨缺損組織的愈合情況、新生骨組織結構和骨密度的變化以及骨重建微環(huán)境中ALP、Col-I的表達以及Runx2、OCN的轉錄水平,初步研究BMSCs和HUVECs復合HA-TCP支架共培養(yǎng)技術構建的組織工程骨修復SD大鼠顱骨大面積缺損時的成骨能力,為探討修復口腔頜面部臨界骨缺損的治療方法奠定前期研究基礎。方法:建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,根據(jù)植入支架材料的種類隨機將實驗對象分為4組:(1)A組為空白對照組,即只植入HA-TCP支架;(2)B組為共培養(yǎng)組,即植入BMSCs+HUVECs+HA-TCP支架;(3)C組為骨髓間充質干細胞組,即植入BMSCs+HA-TCP支架;(4)D組為臍靜脈內皮細胞組,即植入HUVECs+HA-TCP支架。分別于術后4周、8周、12周通過Micro-CT掃描觀察組織工程骨修復大鼠顱骨缺損組織的形態(tài)、骨質骨量的動態(tài)變化。并取相應批次大鼠的支架材料及其周圍組織樣本,通過HE和Masson染色觀察不同時間點復合支架組織工程骨修復大鼠顱骨缺損愈合過程中組織形態(tài)和組成的變化,通過免疫組織化學染色觀察不同時間點復合支架組織工程骨修復大鼠顱骨缺損愈合過程中Col-I的分布,并使用image-pro-plus 6.0圖像軟件量化免疫組織化學切片中Col-I的表達,通過ALP活性試劑盒檢測愈合過程中新生骨組織中ALP活性,通過qPCR檢測愈合過程中新生骨組織中Runx2和OCN的轉錄水平的動態(tài)變化。使用SPSS16.0軟件統(tǒng)計處理分析數(shù)據(jù),單因素方差分析比較各組間差異以及Tukey HSD檢驗差異的統(tǒng)計學意義。結果:本實驗成功建立了SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型,成功率為98%。Micro-CT掃描分析結果顯示B組骨痂形成速度最快,骨密度值顯著高于C組和D組,A組骨組織愈合最慢,且骨密度值最低(P0.05),各組骨密度值均隨時間增加而增高,而B組骨密度值上升速度最快;HE和Masson染色結果顯示:與A組、C組、D組比較,B組三維空間逐漸被新生骨代替,支架材料周圍分布較多排列不規(guī)則、較厚的骨小梁,支架材料內部長入較多的新生血管,B組骨痂成熟速度最快;Col-I免疫組織化學染色結果顯示,術后第4、8、12周時A組Col-I基質染色陽性面積均較小,顏色較淺,B組Col-I染色陽性基質面積最大,染色最深,平均光密度值最高,與C組和D組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),而隨時間增加各組Col-I免疫反應陽性染色面積略下降;ALP蛋白活性結果顯示,B組ALP的表達量隨時間增加而升高,12周時達到高峰,C組和D組8周時上升較多,12周時趨于平緩下降,A組各時間段呈緩慢上升趨勢,B組ALP蛋白活性均顯著高于A組、C組和D組(P0.05);qPCR檢測Runx2和OCN的轉錄水平結果顯示,B組可有效促進骨重建微環(huán)境中Runx2和OCN的轉錄水平,其促進效果優(yōu)于A組、C組和D組。結論:通過建立SD大鼠顱骨臨界缺損模型并植入含或不含種子細胞的HA-TCP支架材料。觀察大鼠顱骨缺損組織結構的變化、新生骨組織中ALP活力的變化、Col-I的表達、Runx2和OCN的轉錄水平的變化,探討復合支架技術構建的組織工程骨對大鼠顱骨缺損修復的效果,現(xiàn)得到結論如下:BMSCs和HUVECs復合HA-TCP共培養(yǎng)構建組織工程骨能加速愈合骨痂形成、增加新生骨組織密度、獲得良好的骨組織的生長;能誘導BMSCs向成骨細胞分化,促進骨重建微環(huán)境中ALP、Col-I的表達以及Runx2、OCN的轉錄水平;可能誘導復合支架材料內部新生血管的形成;能成功修復大鼠顱骨臨界骨缺損。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【分類號】：R782
【圖文】：

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文結 果 動物模型建立情況通過建立SD大鼠顱骨缺損模型，植入復合支架技術構建的組織工程察組織工程骨修復大鼠顱骨缺損組織愈合的情況。.1 復合支架組織工程骨的制作情況.1.1 倒置相差顯微鏡下 SD 大鼠原代 BMSCs 的形態(tài)觀察SD 大鼠原代 BMSCs 分離培養(yǎng) 3 天后（圖 1），可見樹突狀、三角形形細胞貼壁生長，且細胞有多個長短不一的突起，細胞核明顯，細富，培養(yǎng) 7 天后可見細胞鋪至瓶底約 90%，準備傳代培養(yǎng) (圖 2)。

西 南 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文結 果 動物模型建立情況通過建立SD大鼠顱骨缺損模型，植入復合支架技術構建的組織工程察組織工程骨修復大鼠顱骨缺損組織愈合的情況。.1 復合支架組織工程骨的制作情況.1.1 倒置相差顯微鏡下 SD 大鼠原代 BMSCs 的形態(tài)觀察SD 大鼠原代 BMSCs 分離培養(yǎng) 3 天后（圖 1），可見樹突狀、三角形形細胞貼壁生長，且細胞有多個長短不一的突起，細胞核明顯，細富，培養(yǎng) 7 天后可見細胞鋪至瓶底約 90%，準備傳代培養(yǎng) (圖 2)。

圖 3 HUVECs 培養(yǎng)第 3 天（40×） 圖 4 HUVECs 培養(yǎng)第 7 天（40×）igure 3 the 3rd days culture of HUVECs (40×) Figure 4 the 7th days culture of HUVECs (40×).1.3 倒置相差顯微鏡下共培養(yǎng)細胞的形態(tài)取第 3 代 BMSCs 和 HUVECs 共培養(yǎng)形態(tài)如圖 5 和圖 6，可見梭形UVECs 和三角形、多角形及樹突狀的 BMSCs，共培養(yǎng) 5 天后可見 BMS滿培養(yǎng)瓶底，0.25%胰蛋白酶消化，將兩種細胞接種于 HA-TCP 支架共培養(yǎng) 7 天后做的掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM）。

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