【摘要】：研究目的:體外無(wú)血清或去外泌體血清條件培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞(hDPCs),分別采用差速離心法和ExoQuickTC試劑盒法分離提取人牙髓細(xì)胞來(lái)源的外泌體并進(jìn)行鑒定,對(duì)獲取外泌體的細(xì)胞培養(yǎng)方法和提取方法進(jìn)行比較,探索獲取人牙髓細(xì)胞外泌體的最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和提取方法。研究方法:1、收集臨床上因正畸拔除的前磨牙(12~26歲),組織塊貼壁法體外培養(yǎng)hDPCs,免疫組織化檢測(cè)波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá)。2、選取第4-6代hDPCs,分別用10%無(wú)外泌體血清條件培養(yǎng)基和無(wú)血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;3、收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液分別采用差速離心法和ExoQuick TC試劑盒法提取外泌體,共獲得四種不同來(lái)源和提取方法的外泌體,分別為:⑴試劑盒無(wú)外泌體血清組(Kit-血清-hDPCs-DEs);⑵試劑盒無(wú)血清組(Kit-hDPCs-DEs));⑶差速離心無(wú)外泌體血清組(UL-血清-h DPCs-DEs);⑷差速離心無(wú)血清組(UL-hDPCs-DEs);4、外泌體的鑒定包括:⑴形態(tài)鑒定,采用透射電鏡觀察提取外泌體的形態(tài);⑵外泌體標(biāo)志蛋白檢測(cè),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)CD63表達(dá)量,蛋白印記法定性分析外泌體標(biāo)志蛋白CD9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、組織塊貼壁法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞傳至第三代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,大小均一,成纖維細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,波形絲蛋白染色陽(yáng)性,角蛋白染色陰性,提示所培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源。2、人牙髓細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng):生長(zhǎng)良好的P3-6代hDPCs更換至無(wú)血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí),鏡下見(jiàn)hDPCs形態(tài)拉長(zhǎng),排列疏松,細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)塌陷;3、人牙髓細(xì)胞在無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng):10%無(wú)外泌體血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)hDPCs 48小時(shí),細(xì)胞形態(tài)均一,胞質(zhì)飽滿,細(xì)胞增殖良好,排列緊密呈旋渦狀生長(zhǎng)。4、外泌體的提取:差速離心法和ExoQuickTC試劑盒法均可分離出直徑在50-100nm之間,膜性結(jié)構(gòu)包裹的外泌體囊泡,差速離心法分離的外泌體可觀察到囊泡破裂的現(xiàn)象;5、外泌體的鑒定和提取濃度測(cè)定:⑴ELISA檢測(cè)CD63的表達(dá),結(jié)果顯示四組細(xì)胞培養(yǎng)上清提取物均表達(dá)CD63;采用差速離心方法獲取的外泌體濃度為:無(wú)外泌體血清hDPCs培養(yǎng)上清液提取的外泌體(UL-血清-h DPCs-DEs)濃度為:(2.5±0.2)×10~8particles;無(wú)血清hDPCs培養(yǎng)上清液獲得外泌體(UL-h DPCs-DEs)濃度為(0.8±0.1)×10~8particles;UL-血清-h DPCs-DEs的濃度高于UL-hDPCs-DEs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。ExoQuickTC試劑盒法獲取的外泌體濃度為:無(wú)外泌體血清hDPCs培養(yǎng)上清液獲得的外泌體(Kit-血清-h DPCs-DEs)濃度為(18.5±4.2)×10~8particles;無(wú)血清hDPCs培養(yǎng)上清液獲得外泌體(Kit-hDPCs-DEs)濃度為(4.22±2.64)×10~8particles;Kit-血清-hDPCs-DEs組濃度高于Kit-hDPCs-DEs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Kit-血清-hDPCs-DEs高于UL-血清-hDPCs-DEs組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);Kit-hDPCs-DEs組濃度與UL-hDPCs-DEs組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。⑵WB檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9,結(jié)果顯示,無(wú)外泌體血清培養(yǎng)條件上清提取物CD9為陽(yáng)性表達(dá),UL-血清-h DPCs-DEs的表達(dá)最強(qiáng),Kit-血清-hDPCs-DEs的表達(dá)較弱。而無(wú)血清培養(yǎng)的上清提取物未能檢測(cè)到CD9的表達(dá)。結(jié)論:與無(wú)血清培養(yǎng)條件相比較,10%無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基更利于hDPCs的生長(zhǎng)和細(xì)胞分泌產(chǎn)生外泌體;ExoQuick TC試劑盒法用較少量的上清即可獲得外泌體,但提取的外泌體純度較低。差速離心法可提取純度較高的外泌體,但存在有外泌體囊泡破裂的情況。結(jié)果提示采用10%無(wú)外泌體血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可促使牙髓細(xì)胞分泌外泌體,提取的方法可根據(jù)研究目的進(jìn)行選擇。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

髓細(xì)胞外泌體的提取與鑒定 碩士學(xué)位論文. 結(jié)果1 hDPCs 的培養(yǎng)與鑒定人牙髓組織塊接種至培養(yǎng)瓶后約 5-10 天，可在倒置相差顯微鏡下觀察牙髓組織周圍有長(zhǎng)梭形或星型的細(xì)胞爬出，細(xì)胞呈光暈狀（圖 1-1，A），胞爬出約 2 周后，細(xì)胞融合至 80%，進(jìn)行原代細(xì)胞的首次傳代。傳代后續(xù)培養(yǎng)至第三代，細(xì)胞大小均一，成纖維細(xì)胞樣形態(tài)穩(wěn)定，緊密排列或旋渦狀生長(zhǎng)，有胞漿凸起互相連接（圖 1-1，B）。免疫組化染色結(jié)果顯，波形絲蛋白染色陽(yáng)性（圖 1-1，C）和角蛋白染色陰性（圖 1-1，D）圖 1-1 人牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

growth with cytoplasmic projections connected to each other (×40-fold); C, vimentinimmunohistochemistry after staining, hDPCs were positive (×200-fold); D, keratin immunohistochemistryafter staining, hDPCs were negative (×200-fold).2.2 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換條件培養(yǎng)基后連續(xù)培養(yǎng) 48h，顯微鏡下觀察到，無(wú)血清條件下培養(yǎng)的 hDPCs 呈饑餓狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，胞體細(xì)長(zhǎng)皺縮，排列稀疏，生長(zhǎng)緩慢，部分細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)塌陷（箭頭所示三維結(jié)構(gòu)塌陷的 hDPCs），甚至死亡（圖 1-2，A）；10%無(wú)外泌體血清條件下培養(yǎng)的 hDPCs 呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞基質(zhì)飽滿,細(xì)胞排列緊密，呈旋渦狀生長(zhǎng)（圖 1-2,B）。圖 1-2：hDPCs 在無(wú)血清條件下和 10%無(wú)外泌體血清條件下的細(xì)胞形態(tài)A、hDPCs 在無(wú)血清條件培養(yǎng)基下培養(yǎng) 48h 后，細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，排列疏松，箭頭所示細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)

.1 外泌體的形態(tài)學(xué)觀察.1.1 ExoQuick TC 試劑盒法ExoQuick TC 試劑盒法提取外泌體較少量的培養(yǎng)上清液即可獲得比離心法更多的沉淀。采用試劑盒法從無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞上清液和 10%泌體血清培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中提取的外泌體，在透射電鏡下均可觀察性結(jié)構(gòu)的外泌體囊泡，但樣品背景雜質(zhì)較多，（圖 2-1A、B）。其中 清-hDPCs-DEs 組中可見(jiàn)典型的茶托狀結(jié)構(gòu)的膜性囊泡，結(jié)構(gòu)完整，單多個(gè)外泌體囊泡聚集疊加（如圖 A 箭頭所示）。在 Kit- hDPCs-DEs 組體數(shù)量少，形態(tài)不典型，囊泡偏小，膜性結(jié)構(gòu)完整（圖 2-1 B 箭頭所示

【參考文獻(xiàn)】

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4 朱軼萍;張光東;吳友農(nóng);;人牙髓細(xì)胞在離體牙髓腔內(nèi)向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究[J];口腔醫(yī)學(xué);2008年01期

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本文編號(hào)：2785713