【摘要】：目的： 骨纖維異常增殖癥(fibrous dysplasia of bone, FD),是一種良性骨纖維組織病損。Robey等認(rèn)為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC)激活型Gsa基因發(fā)生錯(cuò)義突變是導(dǎo)致FD的原因,FD的治療方法很大程度上依賴于對(duì)BMSC生物功能及其如何控制骨再生的研究,因此,從骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中提取骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并測(cè)定其Gsα基因的編碼基因位點(diǎn)進(jìn)行突變分析具有重要理論意義和實(shí)際價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)探討一種從FD病變標(biāo)本中分離、培養(yǎng)BMSC的有效方法,為研究FD的病因和發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ),并對(duì)骨纖維發(fā)育異常的病因?qū)W作初步研究,探討一種關(guān)于頜骨骨纖維異常增殖癥(FD)患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的Gsa蛋白編碼基因位點(diǎn)突變分析的方法驗(yàn)證頜骨骨纖維異常增殖癥的基因突變類型。 方法： 1.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 頜骨FD患者經(jīng)X線及組織病理學(xué)確診,術(shù)中取組織標(biāo)本將其剪碎后沖洗獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察細(xì)胞的形態(tài), 2.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性分析 檢測(cè)獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)標(biāo)志物并用MTT法測(cè)定BMSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 3.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)和鑒定 將獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化,觀察其細(xì)胞形態(tài),用鈣鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶活性并用茜素紅染色法檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成情況。 4.骨纖維異常增殖癥病變標(biāo)本中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞Gsa基因型分析 從獲取的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞提取細(xì)胞DNA,通過(guò)定向誘導(dǎo)突變,巢式PCR及限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切等方法將突變基因擴(kuò)增,并進(jìn)行基因序列測(cè)定。 結(jié)果： 1.原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞密集生長(zhǎng)處呈現(xiàn)旋渦狀,傳代后細(xì)胞均呈漩渦狀生長(zhǎng),排列整齊,多呈長(zhǎng)梭形或多角形,進(jìn)一步純化后,細(xì)胞形態(tài)趨于長(zhǎng)梭形。 2.99%的細(xì)胞表達(dá)CD44和HLA-ABC,不表達(dá)CD34.由生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)：傳代培養(yǎng)的潛伏期為24h,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)在第3-4天,5天后細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期。 3. BMSC細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后,呈現(xiàn)成骨細(xì)胞形態(tài),三角形、多角形,鈣-鈷法行堿性磷酸酶染色,可見(jiàn)大部分細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性反應(yīng),經(jīng)茜素紅染色后可見(jiàn)有形成的鈣結(jié)節(jié)。 4.頜骨FD患者的BMSC中Gsa第201位氨基酸的編碼基因突變G→A或C→T,造成第201位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸或精氨酸突變?yōu)榘腚装彼嵬蛔儭?結(jié)論： 1.在新鮮FD骨標(biāo)本中可以成功提取BMSC,其在體外具有誘導(dǎo)成骨的能力,獲取到的BMSC可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。 2.頜骨FD患者BMSC中Gsa蛋白第201位氨基酸編碼基因位點(diǎn)存在特異性突變,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞激活型Gsa基因發(fā)生錯(cuò)義突變是導(dǎo)致FD的原因 3.巢式PCR是一種檢測(cè)該突變的可靠、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R782

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本文編號(hào)：2781647