【摘要】：目的：侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是由包括侵襲腫瘤周?chē)M織，沿順血液及淋巴系統(tǒng)的運(yùn)行、在靶器官上大量增殖等步驟組成，而且惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移的原因及機(jī)制是十分復(fù)雜的，與其基因水平上的改變是密切相關(guān)的。惡性腫瘤若失去其轉(zhuǎn)移能力，其惡性程度將會(huì)大大的降低，但目前在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域尚沒(méi)有一個(gè)明確的結(jié)論能全面的解釋惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，故針對(duì)于惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的治療目前尚無(wú)特效的方法，而針對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者嘗試攻克腫瘤的途徑之一。 涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是涎腺最常見(jiàn)的，且最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居涎腺惡性腫瘤的第二位，該腫瘤生長(zhǎng)緩慢，對(duì)周?chē)M織浸潤(rùn)性強(qiáng)，治療后局部易復(fù)發(fā)，其主要的生物學(xué)性狀之一是易隨血運(yùn)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的部位以肺為多見(jiàn)，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。目前針對(duì)涎腺腺樣囊性癌（SACC）的治療主要以手術(shù)為主，但是因?yàn)槠鋵?duì)周?chē)M織侵襲性很強(qiáng)，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，故很難通過(guò)手術(shù)一次性切除干凈，而且其對(duì)化療及放療不敏感，預(yù)后不佳，對(duì)于該腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的病例的治療相當(dāng)棘手，尋找一種針對(duì)涎腺腺樣囊性癌治療的有效方法一直是口腔科醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)，并且是一道難題。隨著針對(duì)各種疾病的病因、發(fā)展、治療等過(guò)程的基因及分子水平研究的開(kāi)展及發(fā)展，關(guān)于涎腺腺樣囊性癌基因治療的相關(guān)性研究也逐漸地深入。涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-LM及肺低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-83為同一親本，兩種細(xì)胞之間的差異集中在轉(zhuǎn)移的表型上，其中SACC-LM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯高于SACC-83細(xì)胞。 近幾年來(lái)RNA干擾（RNAinterference, RNAi）研究在不同領(lǐng)域的專(zhuān)家學(xué)者的共同努力下已經(jīng)取得了突破性的飛速進(jìn)展，于2001被《Science》雜志評(píng)為年度十大科學(xué)進(jìn)展之一，并且位列2002年十大科學(xué)進(jìn)展的第一位。RNAi現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年，從1998年開(kāi)始逐漸引起人們的關(guān)注及重視。使用RNAi技術(shù)可以針對(duì)性地抑制沉默特定目的基因進(jìn)而特異性剔除或者關(guān)閉目的基因地表達(dá)，隨著對(duì)RNAi技術(shù)的深入研究及飛速發(fā)展，目前在探索基因功能、傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療等領(lǐng)域均已有RNAi技術(shù)的應(yīng)用。RNAi將體外人工合成的與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence, PTGS)。 過(guò)氧化物增殖體激活物受體(peroxisome proliferators activatedreceptors，PPAR)是最新發(fā)現(xiàn)的一組核激素受體超家族成員之一，其與甲狀腺激素受體、類(lèi)維生素A受體、類(lèi)固醇激素受體、及維生素D受體一樣，均屬于核激素受體，亦被稱(chēng)為脂肪酸受體。研究發(fā)現(xiàn)：人類(lèi)的PPAR有三種亞型，即：PPARα、PPARδ (亦稱(chēng)PPARβ)及PPARγ。其中，PPARγ是目前研究最廣泛的一種。最初，科學(xué)家們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PPAR的天然配體，然而隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)及鑒定方法的不斷完善，現(xiàn)在已有數(shù)百種PPARγ配體被鑒定出來(lái)，并被分為合成配體和天然配體兩種。PPARγ參與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、肥胖等的病理生理過(guò)程并發(fā)揮重要作用，PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織，除脂肪組織外，在人體中的巨噬細(xì)胞及其他脂肪儲(chǔ)存細(xì)胞，如：肝、腎、肺等中均有表達(dá)，肌肉組織基本不表達(dá)，PPARγ的主要表現(xiàn)形式是PPARγ1，表達(dá)范圍廣泛。近期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)口腔頜面部、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PPARγ的表達(dá)，并且其表達(dá)量的高低與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移與否存在著關(guān)系。相關(guān)研究表明，通過(guò)多種手段作用于惡性腫瘤細(xì)胞中的PPARγ及其配體，能夠影響惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，并已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌等一些惡性腫瘤的治療中。PPARγ基因定位于染色體3p25，含有9個(gè)外顯子，其基因組結(jié)構(gòu)覆蓋100kb。 在口腔頜面部惡性腫瘤中，涎腺腺樣囊性癌（SACC）極易經(jīng)血運(yùn)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移以肺部多見(jiàn)。作為惡性腫瘤的重要特征之一，腫瘤若失去轉(zhuǎn)移特性，那么惡性度將大大降低,對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究是攻克腫瘤治療難題不可缺少的重要基礎(chǔ)工作。PPARγ作為目前研究最廣泛、最成熟的核激素受體，有研究表明，其在SACC肺高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中的表達(dá)存在差異，肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的表達(dá)量明顯高于肺低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，但目前有關(guān)PPARγ與SACC遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性的報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)特異性的沉默PPARγ基因的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞體外遷徙能力實(shí)驗(yàn)及建立裸鼠體內(nèi)涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移模型，進(jìn)而探討PPARγ基因沉默后對(duì)SACC肺轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)一步豐富對(duì)SACC轉(zhuǎn)移的研究。 方法： 1PT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞株P(guān)PARγ基因表達(dá)差異 分別提取兩種細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，應(yīng)用PT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPARγ基因表達(dá)量的不同，β-action基因作為對(duì)照，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。 2PPARγ基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)小分子干擾RNA（small interfering，siRNA）的設(shè)計(jì)原則，由武漢晶賽公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建PPARγ基因siRNA表達(dá)載體，同時(shí)選取與PPARγ基因同源性較差的序列作為陰性對(duì)照，構(gòu)建陰性對(duì)照載體，最后將U6啟動(dòng)子序列按照Genbank序列（ACCession number X06980）體外化學(xué)合成后克隆到PPARγ基因siRNA表達(dá)載體，替代原有的啟動(dòng)子，最終獲得所需的siRNA表達(dá)載體。 3轉(zhuǎn)染 按Invitrogen的產(chǎn)品說(shuō)明將陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000和陽(yáng)性質(zhì)粒表達(dá)載體、陰性質(zhì)粒表達(dá)載體、空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-LM和肺低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-83，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為：SACC-LM陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組，SACC-LM陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，SACC-LM空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組；SACC-83陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組，SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，SACC-83空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組。 4鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染48h后熒光倒置顯微鏡下分別在培養(yǎng)各組細(xì)胞的各組孔內(nèi)隨機(jī)取六個(gè)視野觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。 5RT-PCR檢測(cè)PPARγ基因干擾效率 分別提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPARγ基因表達(dá)量的改變，β-action基因作為對(duì)照。 6Transwell小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞體外遷徙能力改變 用Matrigel基質(zhì)膜模擬細(xì)胞外基質(zhì)及Transwell小室檢測(cè)PPARγ基因干擾沉默后SACC-LM及SACC-83細(xì)胞粘附遷徙能力的改變，同時(shí)以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒及空白質(zhì)粒的細(xì)胞做對(duì)照，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。 7裸鼠體內(nèi)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的改變。 4W齡雌性BALB/C nu/nu裸鼠104只，隨機(jī)分成8組，4號(hào)注射器于距尾靜脈尖2-3cm處尾靜脈注入細(xì)胞懸液0.1ml/只，1W后重復(fù)注射一次。8W后將裸鼠處死，嚴(yán)格無(wú)菌條件下解剖，取出肺臟。在顯微鏡下用手術(shù)剪剝離所有肉眼可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶，將分離的轉(zhuǎn)移灶用電子天平稱(chēng)重并記錄，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果： 1以β-action為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)所得的條帶中，SACC-LM組條帶明顯較SACC-83組明亮，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P=0.00＜0.01，存在顯著差異，說(shuō)明SACC-LM細(xì)胞PPARγ基因表達(dá)量明顯高于SACC-83細(xì)胞。 2轉(zhuǎn)染48h后鏡下觀察各組細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均可見(jiàn)明亮的綠色熒光，并計(jì)算得出SACC-LM陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組、SACC-LM陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、SACC-LM空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組， SACC-83陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組、SACC-83空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為87.80%、88.02%、86.51%，88.20%、85.31%、87.76%，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率比較，P=0.609＞0.01，無(wú)明顯差異。 3RNA干擾后所得條帶中，SACC-LM及SACC-83干擾組條帶較其他三組對(duì)照組相比明顯變暗，說(shuō)明RNA干擾后SACC-LM及SACC-83細(xì)胞中PPARγ基因表達(dá)量均顯著降低。 4RNA干擾后SACC-LM及SACC-83細(xì)胞穿過(guò)Matrigel人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，P=0.00＜0.05，而SACC-LM陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)均值與SACC-83組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組及SACC-83空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組相近，P=0.444＞0.05。 58組裸鼠體內(nèi)除肺臟以外，其他部位均未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)腫大。SACC-LM組經(jīng)PPARγ基因沉默干擾后的細(xì)胞株裸鼠體內(nèi)的肺部轉(zhuǎn)移灶在肉眼下明顯減少變小，且SACC-83組經(jīng)PPARγ基因干擾后的細(xì)胞株裸鼠體內(nèi)的肺部在肉眼下觀察無(wú)明顯可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。SACC-LM陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組、SACC-83陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶重量均值與各自對(duì)照組細(xì)胞株相比顯著減輕，P=0.00＜0.05，有顯著差異，而SACC-LM陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶重量均值與SACC-83組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組及SACC-83空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，P=0.301＞0.05，無(wú)顯著差異。 結(jié)論： 特異性地抑制PPARγ基因,沉默其表達(dá)后,SACC細(xì)胞株體外遷徙能力及肺部轉(zhuǎn)移能力明顯降低，證實(shí)，特異性地抑制SACC細(xì)胞株P(guān)PARγ基因的表達(dá)能夠減低其轉(zhuǎn)移能力，PPARγ基因在SACC轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，PPARγ有可能成為治療SACC的新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.87

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李明,母義明,馬芳玲,汪保安,竇京濤,陸菊明,李江源,潘長(zhǎng)玉;核受體激動(dòng)劑對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞芳香化酶的調(diào)節(jié)作用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年06期

2 孔蕾;張家文;于甬華;黃偉;何翔;唐磊;余美佳;何為;;PPARγ、PTEN、P27~(kipl)在雌激素依賴(lài)型和非雌激素依賴(lài)型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志;2007年06期

3 康睿,唐道林,曹勵(lì)之;RNA干擾在功能基因組學(xué)和疾病基因治療中應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊(cè));2004年05期

4 董育瑋,王興鵬;PPARs在消化道腫瘤發(fā)生中的作用及其機(jī)制[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(消化系疾病分冊(cè));2002年02期

5 馬秀梅;左連富;劉江惠;郭建文;劉穎;;人胃癌組織中PPARγ的表達(dá)及其配體對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2006年03期

6 沈丹;鄧長(zhǎng)生;;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其激動(dòng)劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[J];臨床內(nèi)科雜志;2008年01期

7 劉曉華;張引成;任文豪;曹騰騰;魏虹;;RNA干擾沉默涎腺黏液表皮樣癌Mc3細(xì)胞HER2基因表達(dá)[J];華西醫(yī)學(xué);2010年02期

8 盛立紅;王輝;張繪宇;康佳麗;杜洪;;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)在宮頸癌中的表達(dá)及意義[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年10期

9 朱理輝;張王利;;PPARγ激活劑羅格列酮對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞周期及其PTEN表達(dá)的影響[J];實(shí)用癌癥雜志;2006年03期

10 王紅霞;張貴宇;;PPARs在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其激動(dòng)劑對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展;2007年02期

本文編號(hào)：2779604