【摘要】：目的：侵襲性和轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是由包括侵襲腫瘤周圍組織，沿順血液及淋巴系統(tǒng)的運行、在靶器官上大量增殖等步驟組成，而且惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移的原因及機制是十分復(fù)雜的，與其基因水平上的改變是密切相關(guān)的。惡性腫瘤若失去其轉(zhuǎn)移能力，其惡性程度將會大大的降低，但目前在醫(yī)學科研領(lǐng)域尚沒有一個明確的結(jié)論能全面的解釋惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，故針對于惡性腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的治療目前尚無特效的方法，而針對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究已經(jīng)成為醫(yī)學科學工作者嘗試攻克腫瘤的途徑之一。 涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma, SACC）是涎腺最常見的，且最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居涎腺惡性腫瘤的第二位，該腫瘤生長緩慢，對周圍組織浸潤性強，治療后局部易復(fù)發(fā)，其主要的生物學性狀之一是易隨血運發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的部位以肺為多見，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一。目前針對涎腺腺樣囊性癌（SACC）的治療主要以手術(shù)為主，但是因為其對周圍組織侵襲性很強，呈浸潤性生長，故很難通過手術(shù)一次性切除干凈，而且其對化療及放療不敏感，預(yù)后不佳，對于該腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的病例的治療相當棘手，尋找一種針對涎腺腺樣囊性癌治療的有效方法一直是口腔科醫(yī)學工作者關(guān)注的焦點，并且是一道難題。隨著針對各種疾病的病因、發(fā)展、治療等過程的基因及分子水平研究的開展及發(fā)展，關(guān)于涎腺腺樣囊性癌基因治療的相關(guān)性研究也逐漸地深入。涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細胞株SACC-LM及肺低轉(zhuǎn)移細胞株SACC-83為同一親本，兩種細胞之間的差異集中在轉(zhuǎn)移的表型上，其中SACC-LM細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯高于SACC-83細胞。 近幾年來RNA干擾（RNAinterference, RNAi）研究在不同領(lǐng)域的專家學者的共同努力下已經(jīng)取得了突破性的飛速進展，于2001被《Science》雜志評為年度十大科學進展之一，并且位列2002年十大科學進展的第一位。RNAi現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年，從1998年開始逐漸引起人們的關(guān)注及重視。使用RNAi技術(shù)可以針對性地抑制沉默特定目的基因進而特異性剔除或者關(guān)閉目的基因地表達，隨著對RNAi技術(shù)的深入研究及飛速發(fā)展，目前在探索基因功能、傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療等領(lǐng)域均已有RNAi技術(shù)的應(yīng)用。RNAi將體外人工合成的與靶基因的mRNA同源互補的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence, PTGS)。 過氧化物增殖體激活物受體(peroxisome proliferators activatedreceptors，PPAR)是最新發(fā)現(xiàn)的一組核激素受體超家族成員之一，其與甲狀腺激素受體、類維生素A受體、類固醇激素受體、及維生素D受體一樣，均屬于核激素受體，亦被稱為脂肪酸受體。研究發(fā)現(xiàn)：人類的PPAR有三種亞型，即：PPARα、PPARδ (亦稱PPARβ)及PPARγ。其中，PPARγ是目前研究最廣泛的一種。最初，科學家們沒有發(fā)現(xiàn)PPAR的天然配體，然而隨著分子生物學相關(guān)技術(shù)及鑒定方法的不斷完善，現(xiàn)在已有數(shù)百種PPARγ配體被鑒定出來，并被分為合成配體和天然配體兩種。PPARγ參與糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥、肥胖等的病理生理過程并發(fā)揮重要作用，PPARγ主要表達于脂肪組織，除脂肪組織外，在人體中的巨噬細胞及其他脂肪儲存細胞，如：肝、腎、肺等中均有表達，肌肉組織基本不表達，PPARγ的主要表現(xiàn)形式是PPARγ1，表達范圍廣泛。近期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在人類口腔頜面部、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PPARγ的表達，并且其表達量的高低與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移與否存在著關(guān)系。相關(guān)研究表明，通過多種手段作用于惡性腫瘤細胞中的PPARγ及其配體，能夠影響惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，并已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌等一些惡性腫瘤的治療中。PPARγ基因定位于染色體3p25，含有9個外顯子，其基因組結(jié)構(gòu)覆蓋100kb。 在口腔頜面部惡性腫瘤中，涎腺腺樣囊性癌（SACC）極易經(jīng)血運發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移以肺部多見。作為惡性腫瘤的重要特征之一，腫瘤若失去轉(zhuǎn)移特性，那么惡性度將大大降低,對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究是攻克腫瘤治療難題不可缺少的重要基礎(chǔ)工作。PPARγ作為目前研究最廣泛、最成熟的核激素受體，有研究表明，其在SACC肺高、低轉(zhuǎn)移細胞株中的表達存在差異，肺高轉(zhuǎn)移細胞株的表達量明顯高于肺低轉(zhuǎn)移細胞株，但目前有關(guān)PPARγ與SACC遠處肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性的報道很少。本實驗采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)特異性的沉默PPARγ基因的表達，并通過細胞體外遷徙能力實驗及建立裸鼠體內(nèi)涎腺腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移模型，進而探討PPARγ基因沉默后對SACC肺轉(zhuǎn)移的影響，進一步豐富對SACC轉(zhuǎn)移的研究。 方法： 1PT-PCR檢測兩種細胞株P(guān)PARγ基因表達差異 分別提取兩種細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，應(yīng)用PT-PCR技術(shù)檢測PPARγ基因表達量的不同，β-action基因作為對照，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理。 2PPARγ基因siRNA表達載體的構(gòu)建 依據(jù)小分子干擾RNA（small interfering，siRNA）的設(shè)計原則，由武漢晶賽公司設(shè)計并構(gòu)建PPARγ基因siRNA表達載體，同時選取與PPARγ基因同源性較差的序列作為陰性對照，構(gòu)建陰性對照載體，最后將U6啟動子序列按照Genbank序列（ACCession number X06980）體外化學合成后克隆到PPARγ基因siRNA表達載體，替代原有的啟動子，最終獲得所需的siRNA表達載體。 3轉(zhuǎn)染 按Invitrogen的產(chǎn)品說明將陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000和陽性質(zhì)粒表達載體、陰性質(zhì)粒表達載體、空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細胞株SACC-LM和肺低轉(zhuǎn)移細胞株SACC-83，轉(zhuǎn)染后細胞分別命名為：SACC-LM陽性轉(zhuǎn)染組，SACC-LM陰性轉(zhuǎn)染對照組，SACC-LM空白轉(zhuǎn)染對照組；SACC-83陽性轉(zhuǎn)染組，SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對照組，SACC-83空白轉(zhuǎn)染對照組。 4鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染48h后熒光倒置顯微鏡下分別在培養(yǎng)各組細胞的各組孔內(nèi)隨機取六個視野觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理。 5RT-PCR檢測PPARγ基因干擾效率 分別提取轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測PPARγ基因表達量的改變，β-action基因作為對照。 6Transwell小室檢測腫瘤細胞體外遷徙能力改變 用Matrigel基質(zhì)膜模擬細胞外基質(zhì)及Transwell小室檢測PPARγ基因干擾沉默后SACC-LM及SACC-83細胞粘附遷徙能力的改變，同時以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒及空白質(zhì)粒的細胞做對照，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理。 7裸鼠體內(nèi)檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的改變。 4W齡雌性BALB/C nu/nu裸鼠104只，隨機分成8組，4號注射器于距尾靜脈尖2-3cm處尾靜脈注入細胞懸液0.1ml/只，1W后重復(fù)注射一次。8W后將裸鼠處死，嚴格無菌條件下解剖，取出肺臟。在顯微鏡下用手術(shù)剪剝離所有肉眼可見轉(zhuǎn)移灶，將分離的轉(zhuǎn)移灶用電子天平稱重并記錄，應(yīng)用SPSS13.0軟件單因素方差分析方法（ANOVA）進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果： 1以β-action為內(nèi)參，實驗所得的條帶中，SACC-LM組條帶明顯較SACC-83組明亮，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，P=0.00＜0.01，存在顯著差異，說明SACC-LM細胞PPARγ基因表達量明顯高于SACC-83細胞。 2轉(zhuǎn)染48h后鏡下觀察各組細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中均可見明亮的綠色熒光，并計算得出SACC-LM陽性轉(zhuǎn)染組、SACC-LM陰性轉(zhuǎn)染對照組、SACC-LM空白轉(zhuǎn)染對照組， SACC-83陽性轉(zhuǎn)染組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對照組、SACC-83空白轉(zhuǎn)染對照組各組細胞轉(zhuǎn)染效率分別為87.80%、88.02%、86.51%，88.20%、85.31%、87.76%，各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率比較，P=0.609＞0.01，無明顯差異。 3RNA干擾后所得條帶中，SACC-LM及SACC-83干擾組條帶較其他三組對照組相比明顯變暗，說明RNA干擾后SACC-LM及SACC-83細胞中PPARγ基因表達量均顯著降低。 4RNA干擾后SACC-LM及SACC-83細胞穿過Matrigel人工基底膜的細胞數(shù)量均顯著減少，P=0.00＜0.05，而SACC-LM陽性轉(zhuǎn)染組細胞穿膜數(shù)均值與SACC-83組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對照組及SACC-83空白轉(zhuǎn)染對照組相近，P=0.444＞0.05。 58組裸鼠體內(nèi)除肺臟以外，其他部位均未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)及淋巴結(jié)腫大。SACC-LM組經(jīng)PPARγ基因沉默干擾后的細胞株裸鼠體內(nèi)的肺部轉(zhuǎn)移灶在肉眼下明顯減少變小，且SACC-83組經(jīng)PPARγ基因干擾后的細胞株裸鼠體內(nèi)的肺部在肉眼下觀察無明顯可見轉(zhuǎn)移灶。SACC-LM陽性轉(zhuǎn)染組、SACC-83陽性轉(zhuǎn)染組細胞裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶重量均值與各自對照組細胞株相比顯著減輕，P=0.00＜0.05，有顯著差異，而SACC-LM陽性轉(zhuǎn)染組細胞裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移灶重量均值與SACC-83組、SACC-83陰性轉(zhuǎn)染對照組及SACC-83空白轉(zhuǎn)染對照組相比，P=0.301＞0.05，無顯著差異。 結(jié)論： 特異性地抑制PPARγ基因,沉默其表達后,SACC細胞株體外遷徙能力及肺部轉(zhuǎn)移能力明顯降低，證實，特異性地抑制SACC細胞株P(guān)PARγ基因的表達能夠減低其轉(zhuǎn)移能力，PPARγ基因在SACC轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，PPARγ有可能成為治療SACC的新的靶點。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.87

【參考文獻】

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本文編號：2779604