【摘要】：牙周炎是一種慢性感染性疾病,可破壞結(jié)締組織基質(zhì)和細(xì)胞,導(dǎo)致牙槽骨吸收,最終導(dǎo)致牙齒缺失。目前對(duì)牙周炎的治療均無(wú)法恢復(fù)原始的牙周組織結(jié)構(gòu)。組織工程作為重建缺失組織,產(chǎn)生新生組織的技術(shù),為實(shí)現(xiàn)牙周組織再生提供了新的思路和方法。 人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)具有多向分化潛能,可作為牙周組織工程的種子細(xì)胞之一。L-抗壞血酸-2-磷酸酯(L-AS-2-P)是抗壞血酸的衍生物,通過(guò)誘導(dǎo)I型膠原的合成,增加細(xì)胞外基質(zhì)的聚積促進(jìn)細(xì)胞膜片的形成。細(xì)胞膜片克服了傳統(tǒng)支架空間體積大,降解的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞毒性損傷的缺陷,僅依靠增加內(nèi)源性細(xì)胞外基質(zhì)而形成,在保證種子細(xì)胞活性的同時(shí),還可增大細(xì)胞密度。但是單層細(xì)胞膜片內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的含量有限,易收縮,并且在轉(zhuǎn)移時(shí)需要借助承載系統(tǒng),而承托材料在降解時(shí)所釋放的物質(zhì)又成為組織再生的不利因素。因此構(gòu)建操作性能強(qiáng)的膜片是亟待解決的問(wèn)題。 組織工程產(chǎn)品長(zhǎng)期存活,依賴于及時(shí)地建立血供。豐富血供不僅可為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng),還可維持組織穩(wěn)態(tài)。而在組織工程產(chǎn)品血管化發(fā)生過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的作用。但是成體內(nèi)皮細(xì)胞取材不方便,且具有免疫抑制性。脂肪干細(xì)胞(ADSCs)可經(jīng)誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞,而且來(lái)源豐富且無(wú)免疫源性,可為組織工程血管化提供內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。 目的： 1.構(gòu)建hPDLCs膜片三維聚合體和三層復(fù)合膜片 2.嘗試應(yīng)用內(nèi)皮培養(yǎng)基(EGM-2)體外誘導(dǎo)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化,并構(gòu)建PDLCs-ECs-PDLCs的三明治結(jié)構(gòu)復(fù)合膜片 方法： 1.單層膜片的制備 組織塊貼壁法原代培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞,檢測(cè)骨橋蛋白,鑒定其成骨特性。按照不同濃度L-AS-2-P,不同初始接種密度將hPDLCs分組,根據(jù)形成膜片所需時(shí)間最短,膜片可操作性最強(qiáng)的原則,篩選出最適條件。 2.三維聚合體的制備 將刮下的單層hPDLCs膜片在最適培養(yǎng)條件下自然皺縮7d,獲得三維聚合體。觀察其操作性能的改變。并通過(guò)HE染色,觀察聚合體細(xì)胞密度、細(xì)胞外基質(zhì)的情況。 3.三層復(fù)合膜片的制備 在共聚焦培養(yǎng)皿中制備第一層hPDLCs膜片,在6孔板內(nèi)制備第二層和第三層細(xì)胞膜片,然后將6孔板內(nèi)的hPDLCs膜片依次轉(zhuǎn)移到共聚焦培養(yǎng)皿中的第一層膜片上。為觀察細(xì)胞膜片覆合后的狀況,在膜片轉(zhuǎn)移之前,應(yīng)用Hoechst33258熒光染料進(jìn)行細(xì)胞核的染色,分為兩種模式,一為對(duì)第一層和第三層細(xì)胞膜片進(jìn)行熒光染色,二為只對(duì)第二層膜片進(jìn)行染色。膜片覆合完成后即進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。 4.EGM-2誘導(dǎo)ADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化 皮下脂肪組織經(jīng)膠原酶消化后獲得脂肪間充質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)誘導(dǎo)其向成骨、成脂細(xì)胞分化,鑒定其干細(xì)胞特性。繼而應(yīng)用EGM-2誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化,分別在7d、14d進(jìn)行CD31免疫組化染色。 結(jié)果： 1.牙周膜細(xì)胞膜片三維聚合體呈球狀,質(zhì)韌,可隨意切割。HE染色顯示細(xì)胞密度較高,細(xì)胞之間有大量細(xì)胞外基質(zhì)。 2.三層復(fù)合膜片在共聚焦顯微鏡下觀察顯示,熒光細(xì)胞密度和亮度的漸變規(guī)律與膜片應(yīng)用熒光染色的模式一致。 3.脂肪間充質(zhì)細(xì)胞可向成骨、成脂分化,具有干細(xì)胞特性。但經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化至14d時(shí),仍未檢測(cè)到CD31的表達(dá)。 結(jié)論： 1.我們成功構(gòu)建了操作性能較強(qiáng)的PDLCs膜片三維聚合體和三層復(fù)合膜片。 2.在脂肪干細(xì)胞向內(nèi)皮分化過(guò)程中,我們未檢測(cè)到CD31的表達(dá),有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳發(fā)明,吳織芬,金巖;牙周組織工程研究進(jìn)展[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年06期

本文編號(hào)：2766430