【摘要】：目的： 牙齒硬組織發(fā)育過程包括基質(zhì)的形成和礦化的發(fā)生,是在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化形成后,接著開始形成牙本質(zhì)的有機(jī)基質(zhì),由成牙本質(zhì)細(xì)胞形成的Ⅰ型膠原分泌到基質(zhì)中去,與基質(zhì)共同形成最早的牙本質(zhì)基質(zhì)。除了Ⅰ型膠原外,成牙本質(zhì)細(xì)胞還分泌非膠原蛋白,包括：牙本質(zhì)磷蛋白(detin phosphoproteins, DPP)、牙本質(zhì)涎蛋白(detin sialoprotein, DSP)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(detin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)和其他一些生長因子及金屬蛋白酶等。其中DPP、DSP和DSPP屬于牙本質(zhì)特異性蛋白,而DMP1、BSP、OPN、OCN為礦化組織特異性蛋白,它們在誘導(dǎo)細(xì)胞分化及促進(jìn)牙本質(zhì)礦化起重要的作用。在牙本質(zhì)基質(zhì)形成和礦化的過程中,有很多的生長因子,細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等參與進(jìn)來,但它們確切的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。 FHL2(Four and a half LIM domains2)蛋白分子結(jié)構(gòu)中含有4個半LIM結(jié)構(gòu)域,共含有279個氨基酸。其中,LIM結(jié)構(gòu)域是以結(jié)構(gòu)中的前三個蛋白Lin-11、Isl-1和Mec-3的首字母命名的,LIM結(jié)構(gòu)域是含有55個氨基酸殘基的序列,富含半胱氨基酸并含鋅指結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域作為蛋白與蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域,在細(xì)胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架的形成中發(fā)揮著不可替代的作用。而FHL2蛋白作為完全由LIM結(jié)構(gòu)域組成的蛋白同樣發(fā)揮著LIM結(jié)構(gòu)域的功能,并且由于FHL2結(jié)構(gòu)的差異性又有著與LIM結(jié)構(gòu)域不同的作用。研究表明,FHL2通過LIM結(jié)構(gòu)域與某些受體、激酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號分子等蛋白相互作用,在基因表達(dá),蛋白分泌,細(xì)胞分化,形態(tài)發(fā)生、組織形成等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)FHL2蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄共激活子,在成骨細(xì)胞的分化、礦化和骨組織的形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的研究表明FHL2通過轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)整合素蛋白家族、Wnt、 RUNX2等信號通路參與骨組織的形成。牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化及礦化過程中有類似骨組織的硬組織形成,我們推測FHL2可能也參與牙齒硬組織的形成過程。我們課題組前期實(shí)驗結(jié)果表明FHL2在牙齒發(fā)育過程中呈時空特異性表達(dá),FHL2可能對牙胚發(fā)育、細(xì)胞分化(包括成釉細(xì)胞及成牙本質(zhì)細(xì)胞)、形態(tài)發(fā)生及硬組織基質(zhì)的分泌與礦化有重要的調(diào)節(jié)作用。 本實(shí)驗在前期研究基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步檢測FHL2對牙本質(zhì)形成的調(diào)控作用,我們體外培養(yǎng)了人牙髓細(xì)胞,并制備FHL2真核表達(dá)載體質(zhì)粒,將所制備的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞,使之穩(wěn)定過表達(dá)FHL2蛋白,觀察FHL2對人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化及礦化的影響,從而進(jìn)一步闡明FHL2對牙本質(zhì)形成的調(diào)控作用機(jī)制。 材料和方法： 1.組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法培養(yǎng)分離人牙髓細(xì)胞,比較兩方法的差異性,加入礦化誘導(dǎo)液使牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化并礦化,檢測在這一過程中FHL2mRNA和蛋白表達(dá)量的變化。 2.大腸桿菌提取重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質(zhì)粒pcDNA3,雙酶切實(shí)驗和質(zhì)粒測序檢驗重組質(zhì)粒中插入的FHL2基因讀碼框架。 3.將FHL2重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質(zhì)粒pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞,72h后檢測帶有外源基因的重組質(zhì)粒能否在人牙髓細(xì)胞中表達(dá)。 4.將pcDNA3-FHL2-Flag穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞,檢測牙髓細(xì)胞向人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化和礦化過程中,ALP、BSP、OPN及DSPP等蛋白的表達(dá)差異及礦化結(jié)節(jié)的形成情況。 結(jié)果： 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細(xì)胞,成功獲得了人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究模型。 2.加入礦化誘導(dǎo)液后,誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞礦化,Real time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著礦化誘導(dǎo)時間的延長,FHL2蛋白表達(dá)量逐漸增加,誘導(dǎo)7d到14d時FHL2表達(dá)量增加最顯著。 3.重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag經(jīng)酶切鑒定和重組質(zhì)粒測序,結(jié)果顯示加入了編碼正確的FHL2基因,成功制備了基因全長FHL2的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞后經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。RT-PCR結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中具有大量目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄,Western blot檢測培養(yǎng)細(xì)胞中蛋白表達(dá)呈陽性,同時穩(wěn)定表達(dá)FHL2的細(xì)胞可以檢測到標(biāo)簽蛋白Flag。 4.檢測各組牙髓細(xì)胞在向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化及礦化過程中,穩(wěn)定過表達(dá)FHL2的牙髓細(xì)胞中ALP的活性顯著增高；礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量較轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組明顯增加；成骨相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)量均有所上調(diào)。 結(jié)論： 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細(xì)胞,酶消化組織塊法可較早見到細(xì)胞爬出,并且細(xì)胞生長較快且狀態(tài)較好,組織塊法培養(yǎng)牙髓細(xì)胞時間較長,且失敗率較酶消化法高。 2.在人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化及礦化過程中(Od,7d,14d,21d),FHL2的表達(dá)量逐漸增加,提示FHL2可能參與了牙本質(zhì)的形成過程。 3.重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag經(jīng)鑒定加入了正確的FHL2編碼框,瞬時轉(zhuǎn)染牙髓細(xì)胞后,牙髓細(xì)胞可表達(dá)FHL2蛋白和標(biāo)簽蛋白Flag,經(jīng)G418篩選獲得了可以穩(wěn)定表達(dá)FHL2的人牙髓細(xì)胞。說明重組質(zhì)粒pcDNA3-FHL2-Flag可以作為外源性的FHL2基因轉(zhuǎn)染入人牙髓細(xì)胞,從而進(jìn)一步研究FHL2在牙本質(zhì)形成中的作用機(jī)制。 4.穩(wěn)定過表達(dá)FHL2的牙髓細(xì)胞中ALP的活性顯著增高；礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量較轉(zhuǎn)染空載體組和未轉(zhuǎn)染組明顯增加；牙髓細(xì)胞內(nèi)的成骨相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)量均有所上調(diào),提示FHL2在牙髓細(xì)胞的分化和礦化過程中發(fā)揮重要的正調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 盧婧;唐榮銀;李彥;;人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的比較研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2006年06期

2 汪平,郝建軍,史俊南;體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞、牙周韌帶細(xì)胞幾種基質(zhì)表達(dá)和堿性磷酸酶分泌的研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;1996年04期

本文編號：2763297