【摘要】：目的： 牙齒硬組織發(fā)育過程包括基質的形成和礦化的發(fā)生,是在成牙本質細胞分化形成后,接著開始形成牙本質的有機基質,由成牙本質細胞形成的Ⅰ型膠原分泌到基質中去,與基質共同形成最早的牙本質基質。除了Ⅰ型膠原外,成牙本質細胞還分泌非膠原蛋白,包括：牙本質磷蛋白(detin phosphoproteins, DPP)、牙本質涎蛋白(detin sialoprotein, DSP)、牙本質涎磷蛋白(detin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本質基質蛋白1(DMP1)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)和其他一些生長因子及金屬蛋白酶等。其中DPP、DSP和DSPP屬于牙本質特異性蛋白,而DMP1、BSP、OPN、OCN為礦化組織特異性蛋白,它們在誘導細胞分化及促進牙本質礦化起重要的作用。在牙本質基質形成和礦化的過程中,有很多的生長因子,細胞因子和轉錄因子等參與進來,但它們確切的調控機制尚不清楚。 FHL2(Four and a half LIM domains2)蛋白分子結構中含有4個半LIM結構域,共含有279個氨基酸。其中,LIM結構域是以結構中的前三個蛋白Lin-11、Isl-1和Mec-3的首字母命名的,LIM結構域是含有55個氨基酸殘基的序列,富含半胱氨基酸并含鋅指結構的結構域。LIM結構域作為蛋白與蛋白之間相互作用的結構域,在細胞分化、信號轉導和細胞骨架的形成中發(fā)揮著不可替代的作用。而FHL2蛋白作為完全由LIM結構域組成的蛋白同樣發(fā)揮著LIM結構域的功能,并且由于FHL2結構的差異性又有著與LIM結構域不同的作用。研究表明,FHL2通過LIM結構域與某些受體、激酶、轉錄因子、信號分子等蛋白相互作用,在基因表達,蛋白分泌,細胞分化,形態(tài)發(fā)生、組織形成等過程中發(fā)揮著重要的調控作用。近年來研究發(fā)現FHL2蛋白作為重要的轉錄共激活子,在成骨細胞的分化、礦化和骨組織的形成中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。進一步的研究表明FHL2通過轉錄共調節(jié)整合素蛋白家族、Wnt、 RUNX2等信號通路參與骨組織的形成。牙髓細胞向成牙本質細胞分化及礦化過程中有類似骨組織的硬組織形成,我們推測FHL2可能也參與牙齒硬組織的形成過程。我們課題組前期實驗結果表明FHL2在牙齒發(fā)育過程中呈時空特異性表達,FHL2可能對牙胚發(fā)育、細胞分化(包括成釉細胞及成牙本質細胞)、形態(tài)發(fā)生及硬組織基質的分泌與礦化有重要的調節(jié)作用。 本實驗在前期研究基礎上,為進一步檢測FHL2對牙本質形成的調控作用,我們體外培養(yǎng)了人牙髓細胞,并制備FHL2真核表達載體質粒,將所制備的質粒轉染入人牙髓細胞,使之穩(wěn)定過表達FHL2蛋白,觀察FHL2對人牙髓細胞向成牙本質細胞樣細胞分化及礦化的影響,從而進一步闡明FHL2對牙本質形成的調控作用機制。 材料和方法： 1.組織塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法培養(yǎng)分離人牙髓細胞,比較兩方法的差異性,加入礦化誘導液使牙髓細胞向成牙本質細胞樣細胞分化并礦化,檢測在這一過程中FHL2mRNA和蛋白表達量的變化。 2.大腸桿菌提取重組質粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質粒pcDNA3,雙酶切實驗和質粒測序檢驗重組質粒中插入的FHL2基因讀碼框架。 3.將FHL2重組質粒pcDNA3-FHL2-Flag和空載體質粒pcDNA3瞬時轉染入人牙髓細胞,72h后檢測帶有外源基因的重組質粒能否在人牙髓細胞中表達。 4.將pcDNA3-FHL2-Flag穩(wěn)定轉染入人牙髓細胞,檢測牙髓細胞向人成牙本質細胞樣細胞分化和礦化過程中,ALP、BSP、OPN及DSPP等蛋白的表達差異及礦化結節(jié)的形成情況。 結果： 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細胞,成功獲得了人牙髓細胞體外培養(yǎng)的研究模型。 2.加入礦化誘導液后,誘導牙髓細胞礦化,Real time PCR和Western blot檢測發(fā)現隨著礦化誘導時間的延長,FHL2蛋白表達量逐漸增加,誘導7d到14d時FHL2表達量增加最顯著。 3.重組質粒pcDNA3-FHL2-Flag經酶切鑒定和重組質粒測序,結果顯示加入了編碼正確的FHL2基因,成功制備了基因全長FHL2的真核表達載體,轉染人牙髓細胞后經G418篩選獲得穩(wěn)定表達株。RT-PCR結果顯示穩(wěn)定轉染細胞中具有大量目的基因mRNA轉錄,Western blot檢測培養(yǎng)細胞中蛋白表達呈陽性,同時穩(wěn)定表達FHL2的細胞可以檢測到標簽蛋白Flag。 4.檢測各組牙髓細胞在向成牙本質細胞樣細胞分化及礦化過程中,穩(wěn)定過表達FHL2的牙髓細胞中ALP的活性顯著增高；礦化結節(jié)形成的數量較轉染空載體組和未轉染組明顯增加；成骨相關因子mRNA和蛋白表達量均有所上調。 結論： 1.利用組織塊法和酶消化組織塊法均可分離培養(yǎng)出牙髓細胞,酶消化組織塊法可較早見到細胞爬出,并且細胞生長較快且狀態(tài)較好,組織塊法培養(yǎng)牙髓細胞時間較長,且失敗率較酶消化法高。 2.在人牙髓細胞向成牙本質細胞樣細胞的分化及礦化過程中(Od,7d,14d,21d),FHL2的表達量逐漸增加,提示FHL2可能參與了牙本質的形成過程。 3.重組質粒pcDNA3-FHL2-Flag經鑒定加入了正確的FHL2編碼框,瞬時轉染牙髓細胞后,牙髓細胞可表達FHL2蛋白和標簽蛋白Flag,經G418篩選獲得了可以穩(wěn)定表達FHL2的人牙髓細胞。說明重組質粒pcDNA3-FHL2-Flag可以作為外源性的FHL2基因轉染入人牙髓細胞,從而進一步研究FHL2在牙本質形成中的作用機制。 4.穩(wěn)定過表達FHL2的牙髓細胞中ALP的活性顯著增高；礦化結節(jié)形成的數量較轉染空載體組和未轉染組明顯增加；牙髓細胞內的成骨相關因子mRNA和蛋白表達量均有所上調,提示FHL2在牙髓細胞的分化和礦化過程中發(fā)揮重要的正調控作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R781

【參考文獻】

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1 盧婧;唐榮銀;李彥;;人牙髓細胞原代培養(yǎng)方法的比較研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2006年06期

2 汪平,郝建軍,史俊南;體外培養(yǎng)的人牙髓細胞、牙周韌帶細胞幾種基質表達和堿性磷酸酶分泌的研究[J];牙體牙髓牙周病學雜志;1996年04期

本文編號：2763297