人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 11:13

【摘要】：目的:神經(jīng)系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)對生理功能活動調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用的系統(tǒng),主要由神經(jīng)組織構(gòu)成。而神經(jīng)組織由神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成,神經(jīng)細(xì)胞又稱神經(jīng)元,是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能基本單位。神經(jīng)元數(shù)量龐大,它們具有接受刺激、傳導(dǎo)沖動和整合信息的能力,同時(shí)具有內(nèi)分泌功能。然而,神經(jīng)組織受到損傷后,神經(jīng)細(xì)胞難以再生。因此,神經(jīng)系統(tǒng)疾病的再生修復(fù)治療成為臨床疾病治療中的難點(diǎn)之一。牙齦作為口腔牙周支持組織之一,其位置表淺,取材方便,修復(fù)能力極強(qiáng)。有研究表明,牙齦成纖維細(xì)胞具有分化為其他組織細(xì)胞,如血管內(nèi)皮樣細(xì)胞,血管平滑肌樣細(xì)胞和骨骼肌樣細(xì)胞的潛能。本實(shí)驗(yàn)擬將牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,探討做為組織細(xì)胞的牙齦成纖維細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞方向分化的可能性,為神經(jīng)元的再生提供新的細(xì)胞來源。方法:1.人牙齦成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)收集河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科阻生齒拔除后切除的正常牙齦組織,采用原代培養(yǎng)中組織塊貼壁法培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)液選取含雙抗的15%胎牛血清低糖DMEM,0.25%胰酶消化傳代。2.人牙齦成纖維細(xì)胞的鑒定成纖維細(xì)胞傳至第4代,細(xì)胞爬片后固定。采用鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體,進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,同時(shí)采用鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein GFAP)單克隆抗體和鼠抗人微管相關(guān)蛋白(Microtubule-associated protein-2,MAP-2)單克隆抗體做為陰性對照鑒定。3.人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)樣細(xì)胞取第4代對數(shù)生長期的人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。采用含15%胎牛血清的低糖DMEM,其中添加1mmol/L?巰基乙醇(?-ME),20μmol/L維甲酸(RA),2%二甲基亞砜(DMSO),連續(xù)誘導(dǎo)12d觀察。4.神經(jīng)樣細(xì)胞的鑒定采用鼠抗人vimentin單克隆抗體,GFAP單克隆抗體和MAP-2單克隆抗體對誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。采用鼠抗人GFAP和MAP-2單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光化學(xué)鑒定。5酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)樣細(xì)胞的分泌功能及含量分別留取成纖維細(xì)胞和誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞培養(yǎng)液,記為對照組和誘導(dǎo)組。應(yīng)用ELISA法檢測神經(jīng)樣細(xì)胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)種類及含量。同時(shí)收集兩組(對照組和誘導(dǎo)組)數(shù)據(jù),所得結(jié)果用(?)±S表示,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中配對t檢驗(yàn)的方法對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,并且繪制條圖,得出P值,用P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后計(jì)算測得神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量。結(jié)果:1.人牙齦成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)牙齦組織塊培養(yǎng)7-9d,組織塊周圍有細(xì)胞爬出,細(xì)胞呈長梭形,旋渦狀生長,細(xì)胞體及胞核大,核呈圓形或橢圓形,有2-3個(gè)核仁。2.人牙齦成纖維細(xì)胞的鑒定采用第4代人牙齦成纖維細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。結(jié)果顯示,成纖維細(xì)胞抗vimentin呈陽性,胞漿被染成棕黃色,抗GFAP和MAP-2呈陰性,胞漿未被染成棕黃色。3.誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞為神經(jīng)樣細(xì)胞取第4代對數(shù)生長期的人牙齦成纖維細(xì)胞,用誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12d后,可見多數(shù)細(xì)胞胞體由長梭形變?yōu)槿切位蛘叨嘟切?突起變細(xì)變長,大多數(shù)為三極。突起之間互相連接成網(wǎng)狀。4.神經(jīng)樣細(xì)胞的鑒定將誘導(dǎo)12d后的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)和免疫熒光化學(xué)反應(yīng)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細(xì)胞抗GFAP呈陽性,抗MAP-2呈陽性,抗vimentin呈陽性。免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細(xì)胞抗GFAP和MAP-2均呈陽性。5.ElISA結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細(xì)胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)為多巴胺和乙酰膽堿。誘導(dǎo)組和對照組中乙酰膽堿和多巴胺的含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)的濃度大約為75 pg/ml,多巴胺(Dopamine,DA)的濃度大約為56.25 pg/ml。結(jié)論:1.人牙齦成纖維細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。2.誘導(dǎo)形成的神經(jīng)樣細(xì)胞可以分泌神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和多巴胺。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：