【摘要】：目的:神經(jīng)系統(tǒng)是機體內(nèi)對生理功能活動調(diào)節(jié)起主導作用的系統(tǒng),主要由神經(jīng)組織構成。而神經(jīng)組織由神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成,神經(jīng)細胞又稱神經(jīng)元,是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構和功能基本單位。神經(jīng)元數(shù)量龐大,它們具有接受刺激、傳導沖動和整合信息的能力,同時具有內(nèi)分泌功能。然而,神經(jīng)組織受到損傷后,神經(jīng)細胞難以再生。因此,神經(jīng)系統(tǒng)疾病的再生修復治療成為臨床疾病治療中的難點之一。牙齦作為口腔牙周支持組織之一,其位置表淺,取材方便,修復能力極強。有研究表明,牙齦成纖維細胞具有分化為其他組織細胞,如血管內(nèi)皮樣細胞,血管平滑肌樣細胞和骨骼肌樣細胞的潛能。本實驗擬將牙齦成纖維細胞誘導分化為神經(jīng)樣細胞,探討做為組織細胞的牙齦成纖維細胞向神經(jīng)樣細胞方向分化的可能性,為神經(jīng)元的再生提供新的細胞來源。方法:1.人牙齦成纖維細胞的分離培養(yǎng)收集河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科阻生齒拔除后切除的正常牙齦組織,采用原代培養(yǎng)中組織塊貼壁法培養(yǎng)牙齦成纖維細胞。培養(yǎng)液選取含雙抗的15%胎牛血清低糖DMEM,0.25%胰酶消化傳代。2.人牙齦成纖維細胞的鑒定成纖維細胞傳至第4代,細胞爬片后固定。采用鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體,進行免疫細胞化學鑒定,同時采用鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein GFAP)單克隆抗體和鼠抗人微管相關蛋白(Microtubule-associated protein-2,MAP-2)單克隆抗體做為陰性對照鑒定。3.人牙齦成纖維細胞誘導為神經(jīng)樣細胞取第4代對數(shù)生長期的人牙齦成纖維細胞進行誘導。采用含15%胎牛血清的低糖DMEM,其中添加1mmol/L?巰基乙醇(?-ME),20μmol/L維甲酸(RA),2%二甲基亞砜(DMSO),連續(xù)誘導12d觀察。4.神經(jīng)樣細胞的鑒定采用鼠抗人vimentin單克隆抗體,GFAP單克隆抗體和MAP-2單克隆抗體對誘導后的神經(jīng)樣細胞進行免疫細胞化學染色。采用鼠抗人GFAP和MAP-2單克隆抗體進行免疫熒光化學鑒定。5酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)實驗檢測神經(jīng)樣細胞的分泌功能及含量分別留取成纖維細胞和誘導后神經(jīng)樣細胞培養(yǎng)液,記為對照組和誘導組。應用ELISA法檢測神經(jīng)樣細胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)種類及含量。同時收集兩組(對照組和誘導組)數(shù)據(jù),所得結(jié)果用(?)±S表示,采用統(tǒng)計學中配對t檢驗的方法對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,并且繪制條圖,得出P值,用P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。最后計算測得神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量。結(jié)果:1.人牙齦成纖維細胞的分離培養(yǎng)牙齦組織塊培養(yǎng)7-9d,組織塊周圍有細胞爬出,細胞呈長梭形,旋渦狀生長,細胞體及胞核大,核呈圓形或橢圓形,有2-3個核仁。2.人牙齦成纖維細胞的鑒定采用第4代人牙齦成纖維細胞做免疫細胞化學鑒定。結(jié)果顯示,成纖維細胞抗vimentin呈陽性,胞漿被染成棕黃色,抗GFAP和MAP-2呈陰性,胞漿未被染成棕黃色。3.誘導人牙齦成纖維細胞為神經(jīng)樣細胞取第4代對數(shù)生長期的人牙齦成纖維細胞,用誘導液誘導12d后,可見多數(shù)細胞胞體由長梭形變?yōu)槿切位蛘叨嘟切?突起變細變長,大多數(shù)為三極。突起之間互相連接成網(wǎng)狀。4.神經(jīng)樣細胞的鑒定將誘導12d后的神經(jīng)樣細胞進行免疫細胞化學反應和免疫熒光化學反應。免疫細胞化學結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細胞抗GFAP呈陽性,抗MAP-2呈陽性,抗vimentin呈陽性。免疫熒光化學結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細胞抗GFAP和MAP-2均呈陽性。5.ElISA結(jié)果顯示,神經(jīng)樣細胞分泌的神經(jīng)遞質(zhì)為多巴胺和乙酰膽堿。誘導組和對照組中乙酰膽堿和多巴胺的含量差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。其中乙酰膽堿(Acetylcholine,Ach)的濃度大約為75 pg/ml,多巴胺(Dopamine,DA)的濃度大約為56.25 pg/ml。結(jié)論:1.人牙齦成纖維細胞能夠誘導分化為神經(jīng)樣細胞。2.誘導形成的神經(jīng)樣細胞可以分泌神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和多巴胺。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：

人牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)

人牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)倒置顯微鏡，×100Fig.2Primarycultureofhumangingivalfibroblasts.

人牙齦成纖維細胞的傳代培養(yǎng)倒置顯微鏡，×200Fig.3Subcultureofhumangingivalfibroblasts.

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李偉;肖世富;;多巴胺系統(tǒng)對阿爾茨海默病患者認知功能影響的研究進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2015年20期

2 繆U

本文編號：2754892