【摘要】：口腔頜面-頭頸癌是世界范圍內第六大常見癌癥,其中口腔頜面部鱗狀細胞癌占80%以上。隨著醫(yī)學科學技術的發(fā)展及各種治療方式的推廣,腫瘤的局部控制率有了明顯的提高,但是,近20年來,口腔癌患者的5年生存率仍然維持在50%-55%,并無明顯改善。隨著腫瘤分子生物學研究的發(fā)展,揭示了惡性腫瘤的發(fā)生與多種癌基因激活、抑癌基因失活和細胞凋亡的調節(jié)紊亂有著密切關系,癌基因的激活和抑癌基因的失活參與了癌癥發(fā)生發(fā)展過程的不同階段。目前對惡性腫瘤的病因、診斷、治療和預后的研究越來越受到人們的重視。尤其是在研究惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展方面更是眾多學者研究探討的熱點和難點。 在口腔癌中,90%是鱗狀細胞癌,其中舌部鱗狀細胞癌的發(fā)病率最高。舌鱗癌的發(fā)生與發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程。之所以發(fā)病率較高而治愈率較低,主要原因是由于口腔癌的浸潤及局部轉移�？谇话┑慕䴘櫫θ绱酥畯�,現(xiàn)在尚不能解釋清楚。雖然眾多學者提出各種腫瘤發(fā)生發(fā)展學說,但是確切的分子生物學機制仍不明了,腫瘤細胞如何獲得浸潤的能力,又是如何穿透基底膜進入血管和淋巴管從而達到局部轉移也需要多年的努力才能揭開其神秘的面紗。 惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移機制雖尚不清楚,但是目前已知,基質金屬蛋白酶類(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)、各種細胞因子及生長因子可以調節(jié)癌細胞的運動。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一個大家族,因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名,其家族成員具有相似的結構,一般由5個功能不同的結構域組成：(1)疏水信號肽序列;(2)前肽區(qū);(3)催化活性區(qū);(4)富含脯氨酸的鉸鏈區(qū);(5)羧基末端區(qū)。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性。各種MMP間具有一定的底物特異性,但不是絕對的。同一種MMP可降解多種細胞外基質成份,而某一種細胞外基質成份又可被多種MMP降解,但不同酶的降解效率可不同。MMPs幾乎能降解細胞外基質(ECM)中的各種蛋白成份,破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障,在腫瘤浸潤及局部轉移中起關鍵性作用,從而在腫瘤浸潤轉移中的作用日益受到重視,以至于MMPs被認為是腫瘤浸潤轉移過程中主要的蛋白水解酶。MMPs的抑制劑可分為天然抑制劑和人工化學合成抑制劑兩大類;天然抑制劑有金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metallo proteinases, TIMP)和α2巨球蛋白(α2macroglobulin),其中前者研究較多。人工化學合成的抑制劑因其可批量生產并有較好的抑制腫瘤浸潤和轉移作用而成為目前的抗癌藥物研究的一個新熱點。所有MMPs的家族成員均可被一組基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)所抑制。在機體內活化的MMPs和TIMPs之間存在一種相對平衡關系,正是這種平衡關系決定了MMPs的活性。一旦改變了這種平衡關系,就將影響細胞間的浸潤能力以及腫瘤的轉移。基質金屬蛋白酶及其抑制劑在口腔舌鱗癌中的研究國內外文獻報道較少,本實驗希望通過研究MMP-3、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的轉錄水平表達、相關關系及意義,能夠對口腔舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的資料和線索,進而對口腔舌鱗癌的預防、診斷和治療提供幫助。 第一部分MMP-3和MMP-13的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的表達及意義 目的 了解MMP-3和MMP-13的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程模型中的表達,推測兩種基質金屬蛋白酶在舌鱗癌中所起作用,及其對臨床的診斷意義。 方法 1.建立SD大鼠舌鱗癌轉變過程的模型SD大鼠50只隨機分成三組,飼養(yǎng)在無特定病原體(specific pathogen free,SPF)動物房,恒溫(20-26℃)、恒濕(45%-50%)的潔凈環(huán)境內。精制飼料喂養(yǎng),24小時光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。正常對照組喂普通自來水,實驗組喂4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)。 2.標本制作16周和24周時分別處死大鼠,取大鼠舌部組織,分為兩部分,一部分用4%多聚甲醛固定,行石蠟包埋,另一部分迅速冰凍于-80℃冰箱內待測。 3.對石蠟包埋組織切片行HE染色,觀察正常對照組舌部組織病理特點并觀察實驗組舌部組織為上皮異常增生和舌鱗癌的病理變化。 4.冰凍于冰箱內的舌部組織用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)方法檢測三組基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的mRNA相對表達量。 5.把正常組、上皮異常增生組和舌鱗癌組的基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的mRNA相對表達量進行三組間的相互比較。 6.采用2-△△ct計算目的基因的相對表達量,應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計并分析。舌鱗癌組、上皮異常增生組和正常組三者之間比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)。 結果 1. SD大鼠舌鱗癌轉變模型建立后的上皮異常增生組HE染色結果顯微鏡下顯示上皮基底細胞極性消失,核漿比例增加,上皮釘突呈滴狀,上皮層次紊亂,有絲分裂相增加,細胞多形性,細胞核濃染,核仁增大,在棘細胞層中單個或成團細胞角化。舌鱗癌組瘤細胞排列疏松,間質較少,癌細胞呈大小不均的圓形,核漿比例大,異型性明顯,核橢圓形、圓形、大小不等,核染色深,核分裂相多見,染色質較粗、深染,核仁多個,說明大鼠舌鱗癌轉變過程模型建立成功。 2.大鼠所取舌部組織熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)結果顯示MMP-3、MMP-13的mRNA在舌鱗癌組表達顯著,在上皮異常增生組表達有所增加,而在正常舌組織中只表現(xiàn)微弱的表達。MMP-3mRNA的相對表達量在舌鱗癌組相對最多,在上皮異常增生組較舌鱗癌組少,但與正常對照組相比增加明顯。MMP-13的mRNA在正常對照組相對表達量較少,上皮異常增生組表達量比正常組顯著增加,而在舌鱗癌組的相對表達量比前兩組都高。 3.統(tǒng)計結果顯示MMP-3的mRNA表達舌鱗癌組與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義,舌鱗癌組與上皮異常增生組比較有統(tǒng)計學意義,并且上皮異常增生組與正常對照組比較也有統(tǒng)計學意義。MMP-13的mRNA相對表達量顯示舌鱗癌組與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義,舌鱗癌組與上皮異常增生組比較有統(tǒng)計學意義,上皮異常增生組與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義。 第二部分TIMP-1和TIMP-2的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變在大鼠舌鱗癌轉變過程中的表達及意義 目的 了解TIMP-1和TIMP-2的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程模型中的表達,推測兩基質金屬蛋白酶在舌鱗癌中所起作用,及其對臨床的診斷意義。 方法 1.建立SD大鼠舌鱗癌轉變過程的模型同第一章 2.標本制作同第一章 3.對石蠟包埋組織切片行HE染色,觀察正常對照組舌部組織病理特點并觀察實驗組舌部組織為上皮異常增生和舌鱗癌的病理變化。 4.冰凍于冰箱內的舌部組織用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的方法檢測三組基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)的mRNA相對表達量。 5.把正常組、上皮異常增生組和舌鱗癌組的基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)的mRNA相對表達量進行三組間的比較。 6.采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量,應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計并分析。舌鱗癌組、上皮異常增生組和正常組三者之間比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)。 結果 1.常規(guī)HE染色中：同第一章 2.大鼠舌部組織熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)結果顯示TIMP-1的mRNA表達在正常組較低,在上皮異常增生組有所增強,而在舌鱗癌組表達顯著增強。TIMP-2的mRNA表達在上皮異常增生組中表達強度比正常舌組織較強,但舌鱗癌組與舌正常組相比顯著增強。TIMP-1 mRNA的相對表達量從正常對照組到舌鱗癌組的變化過程中是呈顯著增強的趨勢,對于TIMP-2 mRNA的相對表達量從正常對照組到上皮異常增生組再到舌鱗癌組的變化也是呈逐漸增加的趨勢。 3.統(tǒng)計學結果顯示TIMP-1和TIMP-2的mRNA的相對表達量均表現(xiàn)出正常對照組與上皮異常增生組比較有統(tǒng)計學意義,舌鱗癌組與正常對照組和上皮異常增生組分別比較均有統(tǒng)計學意義。 第三部分MMP-3、MMP-13與TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的相關關系及意義 目的 研究MMP-3、MMP-13與TIMP-1、TIMP-2的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的相關關系及對臨床的診斷意義和運用價值。 方法 1.建立SD大鼠舌鱗癌轉變過程的模型同前兩章,建立過程同前 2.標本制作同前兩章 3.對石蠟包埋組織切片行HE染色,驗證組織病理變化。 4.冰凍于冰箱內的舌部組織應用熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的方法檢測三組基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的mRNA相對表達量,基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2 (TIMP-2)的mRNA相對表達量。 5.采用2-△△Ct計算目的基因的相對表達量,應用雙變量相關分析探討MMP-3、MMP-13與TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達在大鼠舌鱗癌轉變過程中的相關關系。 結果 動物模型、各組舌組織病理變化及熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)中各基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制劑的相對表達量同前兩章。MMP-3與TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達之間成顯著正相關;MMP-13與TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達成顯著正相關。 全文結論 1. MMP-3與MMP-13的mRNA相對表達量在大鼠舌鱗癌轉變過程中增加。 2. TIMP-1與TIMP-2的mRNA相對表達量在大鼠舌鱗癌轉變過程中增加 3.MMP-3、MMP-13與TIMP-1、TIMP-2的mRNA相對表達在大鼠舌鱗癌轉變過程中存在正相關關系。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8
【圖文】：

第一章MMp一3和MMP一13的力識NA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的表達及意義率為75%(15/20)，中輕度上皮異常增生發(fā)生率為25%(5/20)，取其中合重度異常增生的大鼠用于實驗，其病理變化主要表現(xiàn)為過度角化，基底層數增加及極性消失，上皮釘突呈滴狀，層次紊亂，核濃染，有絲分裂象(圖1一2);大鼠誘癌24周時舌鱗癌發(fā)生率為882%(巧/17，1只麻醉死只不明原因死亡，2只重度上皮異常增生)，取其中8只符合舌鱗癌的大鼠實驗，其病理變化為癌細胞突破基底膜侵入薪膜下層及肌層，形成同心圓的癌巢和層狀癌珠(圖1一3)。

第一章MMP一3和MMP一13的mRNA在大鼠舌鱗癌轉變過程中的表達及意義2.2總RNA純度和完整性檢測結果本實驗相同模板在同一臺PCR儀上進行40次擴增后的擴增曲線呈現(xiàn)“S”型，終點產物量不恒定，Ct值則極具重現(xiàn)性(圖1一4，圖1一5);通過融解曲線分析，出現(xiàn)典型的單一峰，無其他產物的非特異性熒光，說明定量準確(圖l一6，圖1一7)。oD26o值/oD28o的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。總RNA的55rRNA，185rRNA和285rRNA條帶，三條條帶完整，證明總RNA抽提比較完整(圖1一8)，滿足實驗驗要求，可用于進一步實驗。Oe比日RnVsCVCle

2.2總RNA純度和完整性檢測結果本實驗相同模板在同一臺PCR儀上進行40次擴增后的擴增曲線呈現(xiàn)“S”型，終點產物量不恒定，Ct值則極具重現(xiàn)性(圖1一4，圖1一5);通過融解曲線分析，出現(xiàn)典型的單一峰，無其他產物的非特異性熒光，說明定量準確(圖l一6，圖1一7)。oD26o值/oD28o的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染�？俁NA的 55rRNA， 185rRNA和 285rRNA條帶，三條條帶完整，證明總RNA抽提比較完整(圖1一8)

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 周紅艷,刁路明,陳瑩,鄧昊,劉麗江;MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達與胃癌淋巴結轉移及生存時間的關系[J];腫瘤防治研究;2005年05期

本文編號：2749674