發(fā)布時(shí)間：2020-07-10 06:00

【摘要】： 實(shí)體瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)腫瘤血管，從周?chē)汛嬖诘难苤薪?jīng)過(guò)芽生形成新的血管謂之血管生成。血管生成素(Angiopoietins，Angs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的繼內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和酪氨酸激酶受體(VEGF／KDR)之后的另一類(lèi)與血管生成密切相關(guān)的一大家族，不僅在胚胎血管發(fā)育和多種生理狀態(tài)下的血管生成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，還與腫瘤、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下的血管生成密切相關(guān)，但其效應(yīng)和作用機(jī)制尚在不斷的探索之中。 血管生成素家族是一個(gè)既含受體激動(dòng)劑又含受體抑制劑的促血管生成家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4個(gè)成員：Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，均能識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體Tie-2，但效應(yīng)截然不同。Ang-1通過(guò)激活Tie-2，起到穩(wěn)定血管，維持血管壁完整性和調(diào)節(jié)血管功能的作用。Ang-2則通過(guò)抑制Tie-2的磷酸化，離斷血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的結(jié)合，破壞血管穩(wěn)定性，從而參與血管重塑和內(nèi)膜去穩(wěn)定作用，與腫瘤新生血管的生成密切相關(guān)。 目前已檢測(cè)到Ang-2在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，如：胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌，卵巢癌等，且其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤血管形成的數(shù)目，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)。有人用Ang-2轉(zhuǎn)基因的胃癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，結(jié)果表明Ang-2的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)均支持這一結(jié)果；但也有人用Ang-2轉(zhuǎn)基因的Lewis肺癌及TAS乳癌細(xì)胞接種小鼠，發(fā)現(xiàn)Ang-2的高表達(dá)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡，破壞腫瘤血管的完整性，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，這說(shuō)明Ang-2在不同的腫瘤組織中所起效應(yīng)不一樣。最新觀點(diǎn)認(rèn)為，Ang-2在腫瘤形成中有促血管退化和啟動(dòng)血管新生的雙重作用，特別是與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的存在與否密切相關(guān)。其具體效應(yīng)怎樣?可能與哪些機(jī)制有關(guān)?在其作用過(guò)程中和其它促、抑血管生成因子間的相互作用如何?這些均需進(jìn)一步探索。 口腔頜面部腫瘤血供豐富，早期易于血道、淋巴道轉(zhuǎn)移，綜合國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)，Ang-2在口腔頜面部腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中的作用罕見(jiàn)報(bào)道，本課題將檢測(cè)Ang-2在口腔頜面部鱗癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)強(qiáng)度與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系，并建立Ang-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤模型，以進(jìn)一步探討Ang-2在口腔鱗癌生長(zhǎng)中的作用，及其與VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶、一氧化氮等其它促血管生長(zhǎng)因子之間的關(guān)系。 第一部分血管生成素2在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)及意義 一、研究目的 檢測(cè)Ang-2在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)，并分析其表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期等臨床生物學(xué)行為的關(guān)系，以初步了解Ang-2在口腔頜面部惡性腫瘤生長(zhǎng)中的作用。 二、材料方法 1．組織標(biāo)本 選取2003．5——2006．5浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔外科手術(shù)切除的口腔頜面部鱗癌組織及癌旁無(wú)瘤組織。 2．方法 (1)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)Ang-2 mRNA，VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)。 (2)免疫組化半定量法檢測(cè)Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)。 三、結(jié)果 1．Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá) Ang-2 mRNA，VEGF mRNA在癌組織中的表達(dá)為6.86±1.37、9.36±2.75，在癌旁無(wú)瘤組織中的表達(dá)為7.95±2.08、11.03±2.67，差異有顯著意義(P＜0.05)。 2．Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá) Ang-2、VEGF陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿和胞膜中，腫瘤組織中的Ang-2、VEGF蛋白合成明顯活躍，半定量計(jì)分法提示Ang-2、VEGF蛋白在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為53.57％、60.71％；在癌旁無(wú)瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為24.00％、28.00％，差異有顯著意義(P＜0.05) 3．Ang-2表達(dá)強(qiáng)度與口腔頜面部鱗癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系 Ang-2 mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽(yáng)性組的表達(dá)分別為7.07±1.50、6.60±1.21；在Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ、Ⅳ的不同臨床分期組的表達(dá)分別為7.17±1.58、6.59±1.14，差異均無(wú)顯著意義(P＞0.05)。 四、結(jié)論 1．Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)高于癌旁無(wú)瘤組織。 2．Ang-2、VEGF蛋白在口腔頜面部鱗癌中的表達(dá)高于癌旁無(wú)瘤組織，兩者不僅定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，也定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中，提示共同參與了口腔頜面部腫瘤血管的形成。 3．Ang-2的表達(dá)強(qiáng)度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性，這一點(diǎn)需要更大的樣本量進(jìn)一步研證。 第二部分血管生成素2對(duì)舌鱗癌裸鼠移植瘤的成瘤影響 一、研究目的 為進(jìn)一步探討Ang-2在口腔頜面部腫瘤中的成瘤效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建Ang-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113舌鱗癌細(xì)胞系，觀察Ang-2對(duì)舌鱗癌裸鼠體內(nèi)成瘤的影響。 二、研究方法 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和主要試劑 (1)裸鼠：6周齡健康雌性BALB／C裸鼠27只，分三組。 (2)細(xì)胞株：人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113，購(gòu)自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔生物研究所。 (3)克隆質(zhì)粒pBLAST49-hANGPT-2：購(gòu)于Invivogen公司。 2．方法 (1)構(gòu)建pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒。 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：pcDNA3.1(-)B／Ang-2導(dǎo)入Tca8113細(xì)胞系，G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)Ang-2基因的Tca8113細(xì)胞，并以RT-PCR及qRT-PCR法檢測(cè)Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113三組細(xì)胞中Ang-2基因的不同表達(dá)。 (3)裸鼠移植瘤建立：3×10~6個(gè)腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下，觀察移植瘤的成瘤時(shí)間及生長(zhǎng)。 (4)免疫組織化學(xué)法：檢測(cè)各組腫瘤組織內(nèi)Ang-2蛋白的表達(dá)。 三、結(jié)果 1．pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建 Ang-2全長(zhǎng)cDNA純化產(chǎn)物在T4連接酶的作用下與pcDNA3.1(-)B載體進(jìn)行體外基因重組，構(gòu)建pcDNA3.1(-)B／Ang-2重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)酶切法及核酸雙向測(cè)序法鑒定其內(nèi)含hAng-2基因。 2．穩(wěn)轉(zhuǎn)Ang-2基因的Tca8113細(xì)胞系的成功建立 pcDNA3.1(-)B／Ang-2及pcDNA3.1(-)B通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入Tca8113細(xì)胞系，RT-PCR結(jié)果證明只有Tca8113／Ang-2細(xì)胞顯示Ang-2陽(yáng)性條帶，qRT-PCR分析進(jìn)一步檢測(cè)到Tca8113／Ang-2細(xì)胞中Ang-2mRNA的表達(dá)量是內(nèi)源性Ang-2mRNA表達(dá)的7690倍。 3．Ang-2轉(zhuǎn)基因的Tca8113細(xì)胞裸鼠移植瘤的成功建立 免疫組化結(jié)果顯示：在Tca8113／Ang-2組，大量Ang-2陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中，而在Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平證實(shí)了Ang-2轉(zhuǎn)基因的舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立。 4．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌移植瘤成瘤時(shí)間的影響 Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組的平均成瘤時(shí)間分別為13.0、4.7和5.1天，可見(jiàn)Ang-2轉(zhuǎn)基因組成瘤時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組(P＜0.05)。 5．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 Tca8113／Ang-2組腫瘤生長(zhǎng)速度較Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113組明顯滯后(P＜0.05)。5周后平均瘤重分別為0.531±0.398g、1.427±0.903g、1.552±0.663g，Tca8113／Ang-2組瘤重較未轉(zhuǎn)染組明顯降低，差異有顯著意義(P＜0.05)。 四、結(jié)論 1．成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)B／Ang-2，及Ang-2穩(wěn)轉(zhuǎn)的舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113／Ang-2，在此基礎(chǔ)上建立的Ang-2轉(zhuǎn)基因的舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤可作為研究Ang-2在口腔腫瘤中作用的理想動(dòng)物模型。 2．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2延長(zhǎng)了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤的成瘤時(shí)間。 3．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2抑制了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。 第三部分血管生成素2抑制舌鱗癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的有關(guān)機(jī)制探討 一、研究目的 進(jìn)一步研究Ang-2抑制腫瘤生長(zhǎng)的有關(guān)機(jī)制，如：Ang-2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響；對(duì)腫瘤血管形態(tài)及微血管密度的影響；及對(duì)其它血管生成因子(VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS)生成的影響。 二、材料方法 1．組織標(biāo)本 第二部分實(shí)驗(yàn)留置的Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B、Tca8113三組裸鼠移植瘤組織。 2．方法 (1)Real time RT-PCR法：檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表達(dá)。 (2)免疫組化法：檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、FⅧ。 (3)TUNEL法：檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡。 三、結(jié)果 1．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)腫瘤血管的形態(tài)，及微血管密度(MVD)的影響Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組MVD分別為5.88±1.46、5.33±2.00和5.86±2.41，差別無(wú)顯著意義。但Tca8113／Ang-2組血管周?chē)?SMA的表達(dá)稀少，提示血管壁不完整。 2．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡 免疫組化法檢測(cè)Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組腫瘤細(xì)胞的PCNA標(biāo)記指數(shù)分別為34.63±9.40％、57.61±12.26％和54.71±12.82％，Tca8113／Ang-2組較兩對(duì)照組下降(P＜0.05)，TUNEL檢測(cè)顯示Tca8113／Ang-2組腫瘤組織內(nèi)凋亡標(biāo)記指數(shù)(19.00±5.48％)較Tca8113／pcDNA3.1(-)B組和Tca8113組增高(10.22±3.42％、10.71±3.30％)，差別有顯著意義(P＜0.05)。 3．VEGF mRNA在各組移植瘤中的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)VEGF在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113三組腫瘤組織內(nèi)表達(dá)為4.37±2.73、4.63±2.96和5.09±3.94，差別無(wú)顯著意義(P＞0.05)。 4．MMP-2、MMP-9 mRNA在各組移植瘤中的表達(dá) MMP-2 mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達(dá)分別為6.84±3.01、6.76±4.17、8.27±5.24；MMP-9 mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達(dá)分別為8.57±5.13、7.76±4.20、9.23±6.10，差異均無(wú)顯著意義(P＞0.05)。 5．iNOS、eNOS mRNA在各組移植瘤中的表達(dá) iNOS mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達(dá)分別為8.68±5.89、10.13±4.85、9.78±5.76；eNOS mRNA在Tca8113／Ang-2、Tca8113／pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤組織中的表達(dá)分別為10.55±1.77、12.18±2.43、10.78±3.51，差異均無(wú)顯著意義(P＞0.05)。 四、結(jié)論 1．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2破壞了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤血管的形態(tài)，對(duì)微血管密度無(wú)明顯影響。 2．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2抑制了舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。 3．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤中VEGF mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。 4．轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Ang-2對(duì)舌鱗癌Tca8113裸鼠移植瘤中MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8
【圖文】：

GH圖2免疫組化法顯示腫瘤組織及癌旁無(wú)瘤組織中Ang一2、vEGF蛋白的表達(dá)情況(ZooX)A和B:癌旁無(wú)瘤組織中Ang一2不表達(dá)(A)或輕度表達(dá)(B)。C和D:腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞(c)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(D)上均可見(jiàn)Ang一2的較強(qiáng)表達(dá)E和F:癌旁無(wú)瘤組織中VEGF不表達(dá)(E)或輕度表達(dá)(F)。G和H:腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞(G)及血管內(nèi)皮細(xì)胞(H)上均可見(jiàn)VEGF的較強(qiáng)表達(dá)表3腫瘤組織及癌旁無(wú)瘤組織中Ang一2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率比較例數(shù)Ang一2+陽(yáng)性率(%)尸值

PCR純化產(chǎn)物在T4連接酶的作用下與peDNA3.1〔)B載體進(jìn)行體外基因重組構(gòu)建體DNA3.1‘)B俏刀g一2重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，取其中l(wèi)個(gè)克隆，雙酶切后電泳初步鑒定，電泳條帶上可見(jiàn)分子量為 1488bP的片段(圖3)，取質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序(結(jié)果見(jiàn)圖4，5)，測(cè)序結(jié)果與已知的人Ang一2基因序列一致 (accessnum腸沈 :NM001147)

免疫組化結(jié)果顯示:在 Tcas113/Ang一2組，大量Ang一2陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，而在 Tcas113午cDNA3.l(一)B、Tcasll3組只有少量散在、稀疏的淡黃色染色(圖9)，這與其在基因轉(zhuǎn)錄水平的高低是一致的。以上實(shí)驗(yàn)從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了Ang一2轉(zhuǎn)基因的Tca8113舌鱗癌裸鼠移植瘤的成功建立。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2748546